于 欣，于美玲，馬全萍，戴亞東，楊 震

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。在2000年，兩個(gè)獨(dú)立的研究小組從心臟移植受體的外植心臟制備的人心臟左心室cDNA文庫和人淋巴瘤cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的同源物ACE2[1-2]。目前研究[3]表明，ACE2不僅和動脈粥樣硬化、高血壓有關(guān)，也與心律失常有關(guān)。筆者利用生物信息學(xué)一些軟件分析ACE2不同特點(diǎn)，為研究其在臨床常見疾病如心血管疾病發(fā)生與發(fā)展、治療提供了思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取：在數(shù)據(jù)庫https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/檢索從而獲得人的ACE2蛋白序列(Genbank：BAB40370.1)。

1.2 研究方法：①采用在線獲取生物信息學(xué)軟件protparam，用該軟件分析ACE2蛋白的物理、化學(xué)特性；獲得在線軟件ProtScale并用其分析ACE2蛋白疏水性。②利用軟件SignalP 4.0分析ACE2信號肽。首先輸入前70個(gè)氨基酸，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型NN和隱馬爾可夫模型HMM進(jìn)行預(yù)測，一般包括三個(gè)值：S-score、C-score和Y-score。S-score：每個(gè)氨基酸對應(yīng)1個(gè)S值，在結(jié)果顯示的圖標(biāo)中有一個(gè)曲線顯示S值的變化趨勢，利用S平均值來判斷分泌蛋白：若S平均值>0.5，則為分泌蛋白，且存在信號肽。C-score：剪切位點(diǎn)的值，在剪切位點(diǎn)處的C值是最高的。每個(gè)氨基酸會有一個(gè)C值，在剪切位點(diǎn)處的C值是最高的。Y-score：Y值是綜合考慮S值和C值的一個(gè)參數(shù)，其比單獨(dú)考慮C值要精準(zhǔn)，因?yàn)樵谝幌盗兄蠧值可能有不止一個(gè)較高的位點(diǎn)，但是剪切位點(diǎn)只有一個(gè)；此時(shí)的剪切位點(diǎn)就由Y-max值來推測，S值是陡峭的位值和具有高C值的位點(diǎn)，即剪切點(diǎn)。通過Y最大值來判斷信號肽剪切位點(diǎn)。③用軟件TMHMM 2.0Sever對ACE2跨膜結(jié)構(gòu)相關(guān)生物信息特點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。④利用TargetP、PSORTⅡ軟件等全面綜合分析其亞細(xì)胞定位；ACE2入在線亞細(xì)胞定位生物信息工具TargetP，在序列來源項(xiàng)選擇noplant，其他選項(xiàng)用默認(rèn)值，大體預(yù)測ACE2蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布情況，進(jìn)一步采用PSORTⅡ軟件的the k-NN Prediction參數(shù)下進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位檢測。⑤根據(jù)NetPhos2.0和NetOGlyc3.1分別對其磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測和分析。⑥利用生物信息學(xué)Smart軟件和DNAStar軟件分別對ACE2保守結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)及抗原系數(shù)進(jìn)行預(yù)測、分析。⑦Human protein atlas數(shù)據(jù)庫檢索ACE2，進(jìn)行蛋白預(yù)測。所有在線工具網(wǎng)址見文獻(xiàn)[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 ACE2蛋白的物理、化學(xué)特性：ACE2蛋白由805個(gè)氨基酸組成，分子式為C4170H6358N1094O1222S35，其相對分子質(zhì)量是92 491.05，理論等電點(diǎn)pI是5.36。在構(gòu)成ACE2蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，為9.4%，而半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)含量較少，分別占1.0%和2.0%，未發(fā)現(xiàn)吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。帶負(fù)電荷氨基酸殘基[天冬氨酸+谷氨酸(Asp+Glu)]數(shù)為99，帶正電荷氨基酸殘基[精氨酸+賴氨酸(Arg+Lys)]數(shù)為78，不穩(wěn)定系數(shù)為40.10。脂溶指數(shù)為80.55，屬于脂溶性蛋白；總平均親水性為-0.376。

2.2 ACE2蛋白信號肽：結(jié)果顯示，ACE2蛋白N端第15～35位氨基酸的疏水性短肽區(qū)域可引導(dǎo)蛋白質(zhì)的肽鏈通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入腔內(nèi)，我們預(yù)測此疏水性短肽區(qū)域?yàn)樾盘栯?。預(yù)測表明，C預(yù)測Max值為0.427，Y預(yù)測Max值為0.586，S結(jié)果Max值為0.950，其剪切位點(diǎn)在29～30個(gè)氨基酸位置上，且S平均值為0.821。

2.3 ACE2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測：膜蛋白分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)就是蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)的部分，有的蛋白有一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)。結(jié)果表明，ACE2蛋白是由一個(gè)跨膜區(qū)(第741～763位氨基酸)、胞外區(qū)(第1～740位氨基酸)以及胞內(nèi)區(qū)(第764～805位氨基酸)構(gòu)成的膜蛋白。

2.4 ACE2蛋白的亞細(xì)胞定位檢測結(jié)果：結(jié)果顯示，ACE2蛋白分子屬于分泌蛋白，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(44.5%)、高爾基體(33.3%)、漿膜(22.2%)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.5 ACE2蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)分析：NetPhos2.0結(jié)果表明，ACE2蛋白有13個(gè)Ser、8個(gè)Thr、14個(gè)酪氨酸(Tyr)可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。NetOGlyc3.1顯示在位點(diǎn)22、26、108預(yù)測分值大于0.5，標(biāo)記為陽性。

2.6 ACE2蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)多指多肽鏈中的主鏈借助氫鍵(H)形成有規(guī)則卷曲折疊的一維構(gòu)象。本研究利用DNAstar網(wǎng)絡(luò)檢測ACE2蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位，綜合Gamien-Robson和Chou-Famsman2兩種方法，發(fā)現(xiàn)ACE2的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)(44.5%和39.1%)、β折疊(35.3%和23.6%)、轉(zhuǎn)角(10.1%和31.8%)和無規(guī)則卷曲(10.6%)。根據(jù)Jameson woff預(yù)測ACE2的氨基酸，區(qū)段137-138、289、354-355、492-493、690-691、789-790、800區(qū)域抗原指數(shù)較高，其他部位的預(yù)測值表現(xiàn)較低甚至為負(fù)值。綜合分析發(fā)現(xiàn)除第30～56外，其他區(qū)域親水性和氨基酸表面表現(xiàn)指數(shù)偏低，推測此區(qū)域可能是該蛋白的優(yōu)勢抗原表位。

2.7 ACE2蛋白表達(dá)及相互作用：通過在線檢索(http：string-db.org)查詢出ACE2相互作用的蛋白，通過Human protein atlas數(shù)據(jù)庫檢索，ACE在十二指腸、膽囊、腎臟、睪丸等器官組織中蛋白表達(dá)較高。

3 討論

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的同源物，本研究protparam結(jié)果、表明ACE2是一種脂溶性的跨膜蛋白，具有羧肽酶催化活性的跨膜糖蛋白，主要由三部分組成：42個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾端、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外金屬蛋白酶鋅結(jié)合域；ProtScale疏水性分析結(jié)果表明，ACE2蛋白多肽鏈第757號分值最高(3.778，疏水性最強(qiáng))，第771號分值最低(-3.311，親水性極強(qiáng))；比較親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域，發(fā)現(xiàn)親水性區(qū)域面積明顯大于疏水性區(qū)域，提示ACE2蛋白是一種親水性蛋白。SignalP預(yù)測結(jié)果顯示信號肽區(qū)域的S值較高，判斷它具有分泌信號肽。在真核生物中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中常見兩種情況，如糖基化、磷酸化。糖基化多數(shù)是指修飾天冬酰胺(Asn)上的N端，通常糖基化的氨基酸特征序列多為Asn-X-絲氨酸(Ser)-蘇氨酸(Thr)，X可表示為任一種氨基酸。磷酸化多數(shù)具有功能啟動和關(guān)閉作用。NetPhos2.0和NetOGlyc3.1結(jié)果表明ACE2存在磷酸化和糖基化，于是這些提示機(jī)體中ACE2可能需要糖分子/糖鏈等與其他生物分子相互作用發(fā)揮其生物學(xué)作用，同時(shí)它被磷酸化后才能具備調(diào)控生物體某種功能代謝的作用。

從Human protein atlas數(shù)據(jù)庫看出，ACE2的表達(dá)具有一定局限性和高度的組織特異性，從而提示了ACE2在高表達(dá)部位，如心血管、腎臟疾病中具有治療潛力。如果ACE2磷酸化和糖基化，它的上下游底物有哪些？從本研究可以看出ACE2可以參與體內(nèi)很多通路，和很多蛋白發(fā)生密切關(guān)系，如PRCP、AGT、MME等等。ACE2可分別作用于血管緊張素Ⅰ(Angiotensin，AngⅠ)和 AngⅡ，且對Ang Ⅱ的催化效率是對AngⅠ的400倍，生成重要的舒血管物質(zhì)血管緊張素1-7[6](Angiotensin 1-7，Ang1-7)。有研究已經(jīng)確認(rèn)ACE2是RAS的一個(gè)重要的內(nèi)源性負(fù)調(diào)控器，它能夠減輕AngⅡ和血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)介導(dǎo)的有害行為[7]。通過抑制ACE-AngⅡ-AT1R軸減少對器官組織的炎性損傷，具有拮抗和平衡ACE的作用[8-10]，抑制經(jīng)典RAS系統(tǒng)。Mas是Ang(l-7)的功能性受體，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞是ACE2發(fā)揮生物學(xué)作用的主要部位，目前對于ACE2、Ang(1-7)的探索尚在初期階段，可能為心血管等相關(guān)性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)；隨著對ACE2-Ang(1-7)-Mas(受體)軸研究的深入，臨床選用新軸的各成分為基礎(chǔ)作為治療方向，勢必會給心血管疾病的治療注入新的活力。綜上所述，ACE2也豐富了我們對ACE2-Ang(1-7)-Mas系統(tǒng)的理論認(rèn)識。

通過認(rèn)識ACE2的生理特性及其主要生物學(xué)信息研究，為深入開展人ACE2蛋白的酶學(xué)特性和心血管疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供理論參考。希望通過ACE2的預(yù)測分析研究，充實(shí)ACE2的藥理學(xué)作用機(jī)制，從而推動ACE2抑制劑及其候選藥物的研究開發(fā)，為相關(guān)藥物的治療提供新的靶點(diǎn)。