徐澤炎，吳鶯,2

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000;2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

諾如病毒(norovirus, NOV)是引起人類(lèi)非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原, 全球約有50%以上的病毒性胃腸炎是由NOV引起[1]。該病毒引起的急性腸胃炎的發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)。該病毒感染劑量可低至10～100個(gè)病毒粒子，具有很強(qiáng)的外界抵抗力，傳播速度快，極易造成大規(guī)模群體感染事件，尤其易在學(xué)校、幼兒園、養(yǎng)老院等的抵抗力弱的人群聚集地引起暴發(fā)[2]。根據(jù)NOV的傳播途徑，糞便、食品和水可作為檢測(cè)該病毒的主要樣本。為了適應(yīng)NOV疫情暴發(fā)的處置，檢測(cè)技術(shù)必須快速和靈敏。傳統(tǒng)檢測(cè)NOV的方法有電鏡法[3]和免疫學(xué)方法[4]，前者設(shè)備昂貴，操作要求高，敏感性低；后者缺乏可用于捕獲高變異NOV保守性片斷的特異性抗體。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)定與分析NOV全基因組及部分序列已被廣泛應(yīng)用于臨床快速診斷和流行病學(xué)研究[5-6]。

1 基于核酸擴(kuò)增法的NOV檢測(cè)技術(shù)

核酸擴(kuò)增法是目前檢測(cè)該病毒的主要手段，主要包括實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR (real-time quantitative RT-PCR,qRT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)和逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)。由于NOV為單股正鏈RNA病毒[7]，須提取NOV的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 再進(jìn)行PCR。

1.1RT-PCR RT-PCR先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判別。Jiang等[8]采用RT-PCR首次在糞便中發(fā)現(xiàn)NOV。Kojima等[9]針對(duì)NOV衣殼蛋白保守區(qū)的基因序列設(shè)計(jì)的引物GI-SKF/GI-SKR和GⅡ-SKF/GⅡ-SKR是檢測(cè)NOV的理想引物，其引物具有良好的穩(wěn)定性與保守度。該方法比較靈敏，但由于模板和試劑等影響，對(duì)樣品中的模板只能定性，而且因置于開(kāi)放體系中操作，污染風(fēng)險(xiǎn)高。

1.2qRT-PCR 其原理為非特異性熒光染料偶聯(lián)到目標(biāo)特異性探針上，通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，并與加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品比較，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸生成和目的基因的初始量[10]。Kageyama等[11]選擇NOV最保守的基因區(qū)ORF1-ORF2連接區(qū)N/S結(jié)構(gòu)域，設(shè)計(jì)引物COG1F/COG1R和COG2F/COG2R，可用于qRT-PCR檢測(cè)NOV不同基因型。qRT-PCR的敏感性和特異性要高于常規(guī)RT-PCR，能定量快速分析NOV，這對(duì)于致病劑量和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有著重要意義[12]，但qRT-PCR無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種病毒。

1.3RT-LAMP LAMP全程恒溫，其反應(yīng)液中含有大量的甜菜堿，在60～65 ℃時(shí)，DNA雙鏈處于動(dòng)態(tài)平衡之中，有利于引物與靶序列的結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)自我循環(huán)合成大量目的DNA，并產(chǎn)生白色沉淀，結(jié)果的判讀采用直觀觀察渾濁度或濁度閱讀器[13]。張昭華等[14]建立RT-LAMP檢測(cè)病毒性腹瀉樣本的Ⅱ型諾如病毒方法：利用一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物和一條加速引物在62 ℃、70 min內(nèi)充分?jǐn)U增模板RNA。該法和qRT-PCR法比較，兩種方法敏感性一致，但前者檢測(cè)速度快、只需簡(jiǎn)單的加熱器或水浴，觀察結(jié)果簡(jiǎn)單，更適合基層使用。

2 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)NOV

高通量測(cè)序(high-throughput sequencing technology)也稱(chēng)為第二代基因測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)，具有通量高、速度快、成本低等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物包括病毒的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域。由于NOV基因組全長(zhǎng)只有7 500 bp，高通量測(cè)序可從臨床樣本中鑒定NOV[15]，并可追蹤該病毒的基因進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)新突變株，有助于了解病毒的結(jié)構(gòu)、中和表位、抗原變異和宿主受體的關(guān)系[16]。

3 基因芯片技術(shù)檢測(cè)NOV

基因芯片技術(shù)，是將寡核苷酸等DNA探針按一定順序固定在載體上，形成分子點(diǎn)陣，當(dāng)樣品中的核酸與探針發(fā)生雜交后，檢測(cè)和分析雜交信號(hào)[17]。根據(jù)雜交體系分為固相基因芯片技術(shù)和液相基因芯片技術(shù)。該技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)樣品中的多個(gè)基因，或成百上千種樣本中相同的基因，因此，該技術(shù)具有高通量的優(yōu)勢(shì)，并且可以自動(dòng)化和微型化。

3.1液相基因芯片技術(shù) 也稱(chēng)為懸浮芯片(suspension array)技術(shù)或液態(tài)芯片(liquid chip)技術(shù)，是美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)一種具有多指標(biāo)同步分析(unknown x multi-analyte profiling，xMAP)功能的芯片技術(shù)[18-19]。Luminex公司利用微球?yàn)檩d體，微球內(nèi)含有3色熒光，每種微球可以偶聯(lián)特異核酸探針，每個(gè)微球能結(jié)合約1×106個(gè)探針?lè)肿樱s交時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)，再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)合激光檢測(cè)裝置識(shí)別和測(cè)量單個(gè)微球熒光強(qiáng)度，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)字信號(hào)處理器處理，即可判斷結(jié)果。何雅青等[20]將多重RT-PCR結(jié)合液相基因芯片技術(shù)檢測(cè)糞便樣本中A型輪狀病毒和NOV，將PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)這些病毒核酸探針的微球混合物進(jìn)行雜交, 利用Luminex 200液相芯片檢測(cè)儀，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)到這些病毒。Chung等[21]基于液相基因芯片和靜電吸附技術(shù)，快速、敏感地檢測(cè)到牡蠣中的鼠諾如病毒(murine norovirus, MNV)。

3.2基于磁珠的可視化基因芯片技術(shù) 熒光素標(biāo)記芯片技術(shù)需要昂貴的熒光掃描儀判斷結(jié)果，這限制了大規(guī)模地推廣應(yīng)用芯片技術(shù)。基于磁珠的可視化基因芯片(magnetic bead-based visual gene chip)技術(shù)主要利用生物素與鏈霉親合素特異性結(jié)合的特點(diǎn)，采用生物素標(biāo)記樣品核酸，鏈霉親合素包被磁珠或納米金等標(biāo)記物，通過(guò)鏈霉親合素與生物素的親和作用，產(chǎn)生不同顏色的斑點(diǎn)，并且肉眼可以識(shí)別，因此，檢測(cè)結(jié)果可以可視化[22]。史蕾等[23]以生物素標(biāo)記GⅠ型和GⅡ型NOV的引物擴(kuò)增臨床糞便樣本，帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片上GⅠ型和GⅡ型NOV的互補(bǔ)探針結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈，再雜交鏈霉親合素包被的磁珠后，以肉眼或通過(guò)普通顯微鏡觀察。田甜等[24]建立RT-PCR-反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)NOV的方法，也屬于可視化基因芯片技術(shù)，生物素標(biāo)記引物的NOV擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熱變性后，與固定在硝酸纖維素膜上的NOV探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)顯色后判定結(jié)果。

4 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器由生物感應(yīng)元件和信號(hào)處理元件組成，將生物感應(yīng)元件(如核酸、受體、病毒、肽等)固定在換能器上，待測(cè)物與感應(yīng)元件作用后，產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，該信號(hào)被處理元件接受、加工、轉(zhuǎn)換、輸出和定量分析[25]。根據(jù)響應(yīng)信號(hào)分為光學(xué)信號(hào)、化學(xué)信號(hào)和壓電信號(hào)等，生物傳感器技術(shù)也可分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器和壓電晶體傳感器等。

4.1F0F1-ATP合酶(ATPase)生物傳感器 F0F1-ATPase是一個(gè)生物分子馬達(dá)，可以轉(zhuǎn)化生物體內(nèi)的能量。由F0(ab2cn)和F1(α3β3γδε)組成，F(xiàn)0、F1分別位于細(xì)菌囊泡的載色體膜內(nèi)和突出膜外(圖1)。F0利用質(zhì)子跨膜的能量形成旋轉(zhuǎn)矩力；而F1用ATP水解的動(dòng)力來(lái)產(chǎn)生相反的機(jī)械矩力。有研究表明，若不同的負(fù)荷連接在F0F1-ATPase上，可改變F1的旋轉(zhuǎn)速度[26-27]。張捷等[28]根據(jù)NOV的ORF1和ORF2 連接處的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)探針，利用ε亞基抗體-生物素-鏈霉親和素-生物素-NOV探針，將該病毒探針連接在F0F1-ATPase的ε亞基上構(gòu)建生物傳感器(圖1)。當(dāng)探針識(shí)別NOV時(shí)，F(xiàn)0F1-ATPase活性發(fā)生改變，合成不同的ATP，檢測(cè)ATP試劑luciferase/luciferin 判斷結(jié)果。該方法所需儀器簡(jiǎn)單，無(wú)需提取核酸，具有快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)的特點(diǎn)。

注：1，ε亞基單克隆抗體; 2，鏈霉親合素；3，生物素；4，NOV探針；5，NOV病毒。

圖1檢測(cè)NOV的F0F1-ATPase生物傳感器的模式[28]

4.2基于適體(aptamer)-表面等離子共振傳感器技術(shù) 表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)傳感器是一種化學(xué)生物傳感器，其原理是利用光線穿透金屬導(dǎo)電層，引發(fā)其表面的自由電子出現(xiàn)等離子體化。其實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子相互反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，包括鍵的結(jié)合或解離。適體是利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (systematic evolution of ligands by ex-ponential enrichment，SELEX), 從人工合成的文庫(kù)中隨機(jī)篩選出短鏈寡核苷酸(DNA或RNA)。適體通過(guò)氫鍵、疏水作用力、范德華力等作用力，高親和力及高特異性結(jié)合靶標(biāo)分子。首先將適體修飾至SPR基底上，然后適體特異性地識(shí)別目標(biāo)物，導(dǎo)致共振條件發(fā)生變化，并改變SPR的輸出信號(hào)，從而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析檢測(cè)[29]。Giamberardino等[30]首先通過(guò)SELEX篩選與MNV特異性結(jié)合并帶有熒光的單鏈寡核苷酸DNA，作為適體(AG3)，再將5′末端標(biāo)記有巰基的AG3在金硫鍵成鍵驅(qū)動(dòng)作用力下，有序吸附在SPR炭電極的納米金膜(gold nanoparticles-modified screen-printed carbon electrode，GNPs-SPCE)表面，MNV的標(biāo)本流經(jīng)SPR時(shí)，MNV和AG3特異性地結(jié)合，導(dǎo)致SPR的輸出信號(hào)改變(圖2)。該方法敏感，特異性高，對(duì)待測(cè)樣品的純度要求低，不需要對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，適體具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易進(jìn)行修飾、靶標(biāo)范圍廣泛、可反復(fù)使用和長(zhǎng)期保存的優(yōu)點(diǎn)。

4.3基于納米粒子結(jié)合石英晶體微天平傳感器技術(shù) 石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)傳感器，又稱(chēng)電晶體傳感器，其原理是利用石英晶體芯片作為換能器，將芯片表面吸附物質(zhì)的質(zhì)量轉(zhuǎn)換為頻率信號(hào)。QCM作為一種質(zhì)量敏感型壓電傳感器，相對(duì)分子質(zhì)量較小，通過(guò)密度大的金納米顆粒(AuNPs)修飾肽，放大信號(hào)[31]。Hwang等[32]利用噬菌體展示技術(shù)篩選出來(lái)和NOV衣殼蛋白(rP2)高親和力結(jié)合的肽，與巰基(thiol)修飾的金納米顆粒形成的自組裝單層(self-assembly monolayer, SAM)結(jié)合，改善電子的傳遞效率，提高QCM傳感器的檢測(cè)效率(圖3)，具有檢測(cè)時(shí)間短和檢測(cè)限低的優(yōu)勢(shì)。

注：1，吸附在SPR炭電極的納米金膜(GNPs-SPCE); 2，有巰基的適體(AG3)單鏈寡核苷酸; 3，鼠諾如病毒(MNV)。

注：1，利用噬菌體展示技術(shù)篩選出來(lái)肽；2，與thiol修飾金納米的SMA結(jié)合的肽；3，吸附NOV。

5 展望

由于NOV具有感染性強(qiáng)、發(fā)病急、傳播快等特點(diǎn)，易造成大規(guī)模群體感染，因此，能夠快速和準(zhǔn)確地鑒定NOV，顯得非常重要。目前核酸擴(kuò)增法、高通量測(cè)序、基因芯片以及生物傳感器等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)NOV已逐漸成熟，可有效縮短檢驗(yàn)NOV的時(shí)間，提高檢驗(yàn)精度和敏感性。這些技術(shù)在NOV實(shí)際檢測(cè)中具有不同的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。qRT-PCR是目前檢測(cè)NOV的主要手段，由于不可預(yù)測(cè)NOV單核苷酸的多態(tài)性，基于保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物和探針無(wú)法確保檢測(cè)新突變株的敏感性。RT-LAMP檢測(cè)速度快，設(shè)備簡(jiǎn)單，適合基層使用，但還不成熟穩(wěn)定。高通量測(cè)序分析NOV全部基因信息，追蹤NOV的基因進(jìn)化和發(fā)現(xiàn)新突變株，但費(fèi)用相對(duì)昂貴。基因芯片檢測(cè)法是一種高通量、快速的、自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)，用于出入境等需要時(shí)快速篩查NOV感染，但該病毒變異較大，收集與設(shè)計(jì)探針是一個(gè)難題。隨著多學(xué)科的不斷融合滲透，生物傳感器已將生物學(xué)、生物電子學(xué)和微電子學(xué)等學(xué)科結(jié)合起來(lái)，依據(jù)電化學(xué)、光效應(yīng)等來(lái)設(shè)計(jì)探測(cè)裝置，以提高精確度。生物傳感元件的穩(wěn)定性還是一個(gè)難題，此外，如何選擇活性強(qiáng)、敏感性高的生物傳感元件也是需要考慮的問(wèn)題。