吳亮，夏雯，陰晴，戴曉玥，鄒治情，王海波，陳盛霞，易承學(xué)

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212000；3. 鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江212000；4. 鎮(zhèn)江市高等?？茖W(xué)校醫(yī)藥與化材學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212028)

肺炎支原體(Mycoplosmapneumonia, Mp)是社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體之一。5～20歲的兒童和青少年是Mp感染的主要人群。雖然Mp感染具有自限性，但早期診斷和早期治療可以有效縮短病程并減少并發(fā)癥的發(fā)生[1]。支原體肺炎與其他病原體感染的肺炎在臨床癥狀和影像學(xué)上并無明顯差異，并且Mp對常規(guī)治療肺炎或上呼吸道感染的藥物(如青霉素或頭孢菌素)天然耐藥，因此及時(shí)準(zhǔn)確的Mp實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對于支原體肺炎治療具有重要意義[2]。

近年來發(fā)展的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于臨床各種病原體檢測[3]。LAMP技術(shù)較經(jīng)典PCR法或?qū)崟r(shí)熒光PCR法具有快速、高效、特異、靈敏和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，其檢測的靈敏度和特異性高于PCR法[4]。現(xiàn)有報(bào)道的Mp-LAMP檢測技術(shù)在反應(yīng)完畢后需打開PCR管蓋，加入SYBR Green Ⅰ染料或通過瓊脂糖電泳判讀結(jié)果，開蓋操作會增加發(fā)生氣溶膠污染的概率，造成假陽性[5]。通過在LAMP反應(yīng)體系中添加特殊熒光染料SYTO-9，可以實(shí)現(xiàn)在反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物生成，免去開蓋操作，有效避免氣溶膠污染[6]。實(shí)時(shí)熒光LAMP法尚未見應(yīng)用于Mp檢測。本研究建立實(shí)時(shí)熒光LAMP法檢測Mp，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1樣本和質(zhì)粒 收集2018年2—6月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的呼吸道感染住院患兒102例(男56例，女46例，年齡2～11歲)。受試患兒均為使用頭孢類抗菌藥物3 d以上而癥狀無改善者，采集上述患兒咽拭子并提取基因組DNA用于后續(xù)檢測。肺炎支原體P1基因載體(Mp-P1/pET28a)由本室在前期研究中構(gòu)建，質(zhì)粒保存于DH5α菌中。Mp標(biāo)準(zhǔn)菌株(M129株)和Mp標(biāo)準(zhǔn)株(Cpn AR-39株)基因組DNA由南華大學(xué)游曉星教授惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 質(zhì)粒小量提取試劑盒、蛋白酶K溶液(20 mg/mL)和dNTP(上海捷瑞生物公司)，BstDNA聚合酶(哈爾濱新?；蚬?，肺炎支原體核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，上海之江生物科技股份有限公司)，PPLo培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)，熒光染料SYTO-9(Thermo Fisher Scientific公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.1.3LAMP引物 根據(jù)Mp標(biāo)準(zhǔn)菌株(M129)P1基因序列，使用Primer Explorer V4軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增引物，見表1。引物由蘇州泓迅生物科技公司合成。

表1 Mp-P1基因?qū)崟r(shí)熒光LAMP引物序列

1.2方法

1.2.1構(gòu)建P1基因標(biāo)準(zhǔn)品 攜帶Mp-P1/pET28a質(zhì)粒的DH5α菌于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，采用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取Mp-P1/pET28a質(zhì)粒，根據(jù)公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)(/mL)=(6.02×1023)×質(zhì)粒濃度(g/mL)/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，并稀釋制備不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(101copies/μL～106copies/μL)用于后續(xù)研究。

1.2.2咽拭子基因組DNA提取 Mp基因組DNA提取方法參照馮燕玲等[7]報(bào)道，方法如下。在咽拭子中加入2.5 mL生理鹽水，洗滌后取400 μL洗滌液，以12 000 r/min離心10 min，棄上清液。在沉淀中加入50 μL TE緩沖液和2 μL蛋白酶K溶液，55 ℃溫浴1 h，95 ℃溫浴10 min滅活蛋白酶K，以12 000 r/min離心5 min，上清液用于實(shí)時(shí)熒光PCR和實(shí)時(shí)熒光LAMP法檢測。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光LAMP法檢出限 25 μL反應(yīng)體系中含有：0.04 μmol/L引物F3，0.04 μmol/L引物B3，0.5 μmol/L引物FIP，0.5 μmol/L引物BIP，0.08 μmol/L LoopF引物，0.08 μmol/L LoopB引物，8 UBstDNA聚合酶，0.6 mol/L甜菜堿，0.8 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×Thermopol反應(yīng)緩沖液，5 μmol/L SYTO-9染料，不同拷貝數(shù)Mp-P1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品5 μL，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系至25 μL。LAMP擴(kuò)增時(shí)間設(shè)置為60 min，反應(yīng)溫度為63 ℃，間隔1 min讀取熒光。

1.2.4SYBR Green Ⅰ 染料LAMP法檢出限 按1.2.3操作方法配制LAMP反應(yīng)液，并進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加1 μL SYBR Green Ⅰ工作液(1∶10 000)，置于紫外燈下觀察反應(yīng)結(jié)果并拍照記錄。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光LAMP法靈敏度 接種Mp標(biāo)準(zhǔn)菌株至PPLO培養(yǎng)基，于37 ℃溫箱培養(yǎng)至培養(yǎng)液變成黃色，吸取100 μL培養(yǎng)基，并進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋。稀釋倍數(shù)依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8。提取肺炎支原體基因組DNA，分別采用實(shí)時(shí)熒光LAMP法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光LAMP法特異性試驗(yàn) 在實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)體系中分別加入肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和肺炎衣原體基因組DNA各5 μL，以滅菌蒸餾水補(bǔ)足體系至25 μL。采用實(shí)時(shí)熒光LAMP法檢測，觀察上述病原體基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.7臨床應(yīng)用評價(jià) 所收集的臨床標(biāo)本分別采用實(shí)時(shí)熒光LAMP法和肺炎支原體核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測。熒光PCR法嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Stata 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，χ2檢驗(yàn)法分析臨床咽拭子標(biāo)本中肺炎支原體檢出率的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12種LAMP方法檢出限 使用實(shí)時(shí)熒光LAMP法擴(kuò)增含有Mp-P1基因的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為104和105copies/μL時(shí)，僅需5 min即可產(chǎn)生明顯擴(kuò)增，20 min時(shí)即可達(dá)到最大擴(kuò)增拷貝數(shù)；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為103copies/μL時(shí)，實(shí)時(shí)熒光LAMP法仍可以獲得較好擴(kuò)增，達(dá)到最大擴(kuò)增拷貝數(shù)需要1 h(見圖1)。SYBR Green Ⅰ染料LAMP法中，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green Ⅰ染料后，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為104和105copies/μL時(shí)，可以獲得較好的顯色效果，在紫外燈下可見明亮的黃色熒光；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為103、102和101copies/μL時(shí)，未見明顯黃色熒光(見圖2)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光LAMP法檢測Mp-P1基因標(biāo)準(zhǔn)品

注：1—5，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為105、104、103、102、101copies/μL。

圖2常規(guī)LAMP法(SYBR Green Ⅰ 法)檢測Mp-P1基因標(biāo)準(zhǔn)品

2.2實(shí)時(shí)熒光LAMP法靈敏度和特異性結(jié)果 Mp經(jīng)10-6稀釋后，實(shí)時(shí)熒光LAMP法仍可檢出，而實(shí)時(shí)定量PCR法僅可以檢出經(jīng)10-4稀釋后的樣本，實(shí)時(shí)熒光LAMP法靈敏度高于實(shí)時(shí)定量PCR法100倍(見圖3)。本研究中建立的實(shí)時(shí)熒光LAMP法對呼吸道感染中常見菌，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和肺炎衣原體無反應(yīng)，其特異性強(qiáng)(見圖4)。

注：A，實(shí)時(shí)熒光LAMP法；B，實(shí)時(shí)定量PCR法。

圖4 實(shí)時(shí)熒光LAMP法特異性分析

2.32種方法檢測臨床患兒咽拭子中Mp-DNA結(jié)果 所采集的102位患兒咽拭子基因組DNA分別采用實(shí)時(shí)熒光LAMP法和肺炎支原體核酸聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測Mp-DNA，結(jié)果實(shí)時(shí)熒光LAMP檢出率為52.0%(53/102)，肺炎支原體核酸聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)檢出率為49.0%(50/102)，兩者檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.176 5，P>0.05)。

3 討論

目前常用的Mp感染檢測方法主要為快速培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測，但快速培養(yǎng)法需耗時(shí)1周以上才能獲得結(jié)果，敏感性低，且可能出現(xiàn)真菌污染而引起假陽性結(jié)果，無法滿足臨床診斷需求。血清學(xué)檢測是臨床常用的檢測方法，而支原體基因序列中含有大量終止密碼子，無法通過原核表達(dá)技術(shù)獲得重組抗原，難以制備高特異性Mp抗體，尚無法解決檢測中出現(xiàn)的假陽性和假陰性過高的問題。并且患兒治愈后體內(nèi)仍存一定滴度的抗體，易造成假陽性[8]。而某些免疫力低下的患兒，感染后體內(nèi)抗體滴度較低，處于檢測下限，從而出現(xiàn)假陰性[9]。

以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為代表的快速核酸檢測技術(shù)，憑借其快速、特異、靈敏的特點(diǎn)逐漸成為Mp檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但該方法反應(yīng)時(shí)間長，對設(shè)備要求高，難以在基層醫(yī)院中推廣。LAMP的核酸擴(kuò)增方法較傳統(tǒng)PCR具有較多優(yōu)勢，其擴(kuò)增效率極高，60 min內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)靶基因的109～1010倍；擴(kuò)增條件簡單，只需維持60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增即可，不必復(fù)雜的溫控設(shè)備；設(shè)計(jì)4條引物識別靶基因上6個(gè)不同區(qū)域，方法的特異性高。本研究中加入環(huán)引物，可以進(jìn)一步縮短擴(kuò)增時(shí)間，極大地提高檢測效率。本研究結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光LAMP法的靈敏度較實(shí)時(shí)熒光定量PCR法高100倍，并且對呼吸道常見病原體DNA無交叉反應(yīng)。

雖然目前已有采用LAMP法檢測Mp的報(bào)道，但常規(guī)LAMP法是通過直接觀察反應(yīng)副產(chǎn)物或加入染料后(如SYBR Green Ⅰ染料等)直接觀察顯色變化，或通過濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)控，以及瓊脂糖電泳等方式判讀，都存在較大缺陷。僅依靠LAMP反應(yīng)副產(chǎn)物或濁度儀檢測，敏感度較低。由于LAMP法擴(kuò)增效率極高，在開蓋加入染料或電泳操作過程中極易發(fā)生氣溶膠污染，甚至造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)室無法使用。本研究在LAMP反應(yīng)體系中添加一定濃度SYTO-9染料，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物生成情況。SYTO-9為第三代飽和型熒光染料，與SYBR Green Ⅰ等第二代非飽和熒光染料相比，其在飽和濃度下不會抑制DNA鏈合成，熒光信號更強(qiáng)，十分適合于LAMP反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果表明，加入SYTO-9染料后，當(dāng)樣本中靶基因拷貝數(shù)達(dá)到104時(shí)，僅需30 min樣本組熒光即與對照組熒光出現(xiàn)顯著差異。同時(shí)使用實(shí)時(shí)熒光LAMP法和商品化肺炎支原體核酸聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測臨床疑似患兒咽拭子標(biāo)本，Mp-DNA檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于實(shí)時(shí)熒光LAMP法反應(yīng)對儀器要求簡單，反應(yīng)速度快，檢測靈敏度高，值得推廣使用。

致謝：感謝首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院孫紅妹教授和南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院游曉星博士給予的幫助和指導(dǎo)。