蔡德豐，陳運生，朱純青，孟青，肖麗霞，田潔，馬東禮

(1. 深圳市兒童醫(yī)院檢驗科，深圳 518038；2. 亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司，深圳 518000)

急性腹瀉在全球均有較高的發(fā)病率和死亡率，主要發(fā)生在兒童和老年人群[1]。目前引起嬰幼兒及兒童腹瀉的最常見病毒包括輪狀病毒(rotaviruses，RV)、諾如病毒(norovirus，NoV)、腸道腺病毒(adenoviruses，Adv)、扎如病毒(sapovirus，SV)及星狀病毒(human astroviruses，HAstV)[2-3]。目前約40%的腹瀉并不能快速準確診斷出病因[4-5]。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長；免疫學(xué)方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染；單病原體的PCR方法檢測通量較低。本研究首次以兒童常見腹瀉病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作為診斷目標，建立多重PCR-毛細管電泳法檢測體系，以提高兒童腹瀉病毒診斷的效率。

1 材料和方法

1.1臨床樣本與標準毒株 收集2017—2018年深圳市兒童醫(yī)院185例兒童感染性腹瀉(診斷標準：感染性腹瀉診斷標準，WS 271-2007)樣本；Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV的標準毒株(參考品)購于廈門至善生物公司。特異性評價的細菌株及毒株腸致病型大腸埃希菌、痢疾志賀菌、副溶血弧菌、腸炎沙門菌及腸道病毒71型來自深圳市兒童醫(yī)院檢驗科微生物實驗室。

1.2主要試劑和儀器 Hotstart HiTaq一步法RT-PCR Mix(廣東菲鵬生物公司)，引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司(上海)合成，瓊脂糖(西班牙索萊寶生物公司)，磁珠法病毒總核酸提取試劑盒(廣州美基生物公司)，TGuide S32半自動樣本提取儀(北京天根生物公司)；QSEP 100毛細管電泳儀、S1 High resolution凝膠卡匣(中國臺灣光鼎公司)。測序送上海生工生物公司。

1.3核酸提取 將10 μL參考品稀釋至200 μL；配制108/mL各細菌水溶液，95 ℃ 10 min，12 000 r/min 10 min。取200 μL稀釋后參考品、腹瀉樣本及細菌提取液于TGuide S32半自動樣本提取儀上提取核酸，參照磁珠法病毒總核酸提取試劑盒說明書進行。

1.4引物設(shè)計、PCR擴增體系及條件建立 從NCBI等數(shù)據(jù)庫檢索病毒基因組或某個保守基因的全長序列，篩選出相應(yīng)病毒的檢測靶點：Adv(Hexon)、NoV G1(ORF1-ORF2junction1)、NoV G2(ORF1-ORF2junction2)、RV A(NSP3)、HAstV(ORF1-ORF2之間保守序列)、SV(RdRp-VP1junction)；將參考序列保守性最高的500～600 bp候選區(qū)域輸入JCVIPrimer Designer生成候選的簡并引物，引物序列見表1。擴增體系為25 μL：5×OneStep Reverse Buffer(Mg2+)5 μL，10×Solution I 2.5 μL，dNTP 0.05 μL，dN(U)TP 0.35 μL，Primer Pool 2.5 μL，Enzyme Mix 2 μL，模板 5 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR擴增條件方案：(1)55 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每個循環(huán)退火溫度下降0.7 ℃)，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；72 ℃ 5 min。(2)55 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s(每個循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；72 ℃ 5 min。(3)常規(guī)PCR擴增條件：50 ℃ 15 min，95 ℃10 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 60 s，45個循環(huán)；72 ℃ 30 s。并對多重降落PCR、常規(guī)PCR擴增進行比較。取擴增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓160 V，時間35 min，用Biorad PowerPac進行驗證。

表1 本文所使用引物

注：簡并堿基Y代表C/T，R代表A/G，K代表G/T，W代表A/T，M代表A/C。

1.5毛細管電泳檢測 取20 μL擴增后核酸樣本，使用QSEP 100毛細管電泳儀和S1 High resolution凝膠卡匣對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，檢測程序為High Voltage Purge 4 V 60 s；Marker Injection 4 V 10 s；Sample Injection 4 V 2 s；Separation Detection 4 V 210 s，計282 s。使用marker為lower marker：20 bp，upper marker：1 000 bp，YN sep Analyzer 軟件判讀的擴增片段。

1.6體系靈敏度、特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性驗證 將標準毒株(3×1011copies/μL)進行10倍梯度稀釋，濃度范圍3×102～3×310copies/μL，每個濃度進行20次重復(fù)試驗，將能夠檢出的最低稀釋濃度定義為靈敏度。以Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV為目的擴增毒株，以其他引起腹瀉的病原菌(腸致病型大腸埃希菌、痢疾志賀菌、副溶血弧菌、腸炎沙門菌及腸道病毒71型)為非目的病原體制備模板，在優(yōu)化的多重PCR-毛細管電泳體系下進行分析。通過本體系對檢出限進行20次重復(fù)檢測，計算峰面積，根據(jù)峰面積差異計算變異系數(shù)(CV)，評價該方法的重復(fù)性[6]。將PCR擴增試劑25 ℃加速破壞5 d，反復(fù)凍融20次，對濃度為檢出限的稀釋毒株進行檢測，每個病毒重復(fù)檢測5次，評價其穩(wěn)定性。

1.7臨床樣本檢測 采用建立方法檢測185例臨床樣本。

1.8測序驗證 隨機選擇5例建立方法檢測陽性的RV感染樣本，經(jīng)提取核酸后，對編碼RV結(jié)構(gòu)蛋白的VP4及VP7基因設(shè)計引物，進行PCR擴增，擴增條件：50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，53 ℃ 60 s，40個循環(huán)，72 ℃ 30 s。然后對擴增后VP4及VP7基因片段進行雙端測序分析，擴增和測序采用同一對引物，見表1。

2 結(jié)果

2.1標準毒株P(guān)CR產(chǎn)物分析 通過對不同3種擴增條件的比較，最終選擇方案(1)(見1.4)的降落條件，可見5種病毒擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與設(shè)計片段長度一致，引物設(shè)計合理。見圖1。

注：1，Adv；2，HAstV；3，NoV G1；4，NoV G2；5，RV；6，SV；7，5種病毒混合條帶；M，marker。

圖1PCR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2毛細管電泳技術(shù)建立 5種病毒陽性參考品擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后均檢測到相應(yīng)片段，無明顯的干擾雜峰出現(xiàn)，其他腹瀉病原體核酸對反應(yīng)體系無影響，見圖2。各病毒的檢出限及CV分別為：Adv 2.04×103copies/μL，CV=6.96%；HAstV 3.99×103copies/μL，CV=7.24%；SV 8.56×102copies/μL，CV=9.03%；NoV G1 6.94×102copies/μL，CV=7.63%；NoV G2 7.38×103copies/μL，CV=8.12%；RV 2.20×102copies/μL，CV=8.89%。各病毒檢出限的CV均小于10%。擴增試劑在25 ℃ 5 d及反復(fù)凍融20次后，位于檢出限濃度的毒株均能夠檢出。

注：A，RV(91 bp)；B，SV(112 bp)；C，Adv(126 bp)；D，HAstV(241 bp)；E，NoV G2(352 bp)；F，NoV G1(399 bp)；LM，low marker；UM，up marker。

圖25種腹瀉病毒陽性參考品毛細管電泳檢測結(jié)果

2.3臨床樣本檢測結(jié)果 185例臨床腹瀉樣本中132例檢出陽性，陽性率為71.35%。感染方式分析：單病毒感染101例(54.6%)、雙病毒感染31例(16.8%)和無信號陰性樣本53例(28.6%)。其中，Adv 22例(11.9%)、HAstV 10例(5.4%)、NoV G1 0例(0%)、NoV G2 11例(5.9%)、RV A 105例(56.8%)和SV 15例(8.1%)。結(jié)果見圖3。

注：A—E，分別為 Adv和RV(91 bp，125 bp)混合感染、RV和NoV G2(91 bp，356 bp)混合感染、SV(113 bp)感染、RV A(92 bp)感染、Adv(120 bp)感染、HAstV(240 bp)感染；LM，low marker；UM，up marker。

圖3部分臨床樣本核酸毛細管電泳檢測結(jié)果

2.4測序結(jié)果分析 將編碼RV結(jié)構(gòu)蛋白的VP4及VP7基因的測序結(jié)果與GeneBank比對分析，結(jié)果序列一致。VP4及VP7部分測序序列見圖4。

圖4 RV病毒VP4(A)及VP7(B)部分基因片段測序結(jié)果

3 討論

本研究選取病毒保守序列進行PCR分析，在設(shè)計引物同時注意病毒間產(chǎn)物長度的差異化，以便于毛細管電泳的直觀判斷分析。首先對PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，摸索出基于降落PCR技術(shù)的最終擴增反應(yīng)條件，以保證擴增效率及擴增穩(wěn)定性。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，無非特異性擴增條帶；陽性參考品經(jīng)毛細管電泳檢測條帶長度與設(shè)計長度基本一致，未出現(xiàn)明顯非特異性檢測峰；雖YN sep Analyzer軟件判讀后，與實際片段存在一定差異，這與實驗條件中存在誤差有一定關(guān)系，并不影響結(jié)果判斷。本研究建立的方法與大腸埃希菌﹑痢疾志賀菌﹑副溶血弧菌﹑腸炎沙門菌及腸道病毒71型腹瀉病原體無交叉反應(yīng)，特異性強；Adv、NoV G1、RV A、SV及HAstV檢出限均小于5×103copies/μL，NoV G1小于1×104copies/μL，具有較好的敏感性；在重復(fù)性方面，CV均小于10%；擴增試劑在25 ℃ 5 d及反復(fù)凍融20次，位于檢出限濃度的毒株均能夠檢出，穩(wěn)定性較好；通過對輪狀病毒結(jié)構(gòu)基因VP4及VP7進行測序分析，與GeneBank的標準序列一致，具有較高的準確性，能夠滿足臨床實驗室診斷的需求。本檢測方法檢測通量高，適合批量檢測；且分析系統(tǒng)能夠?qū)γ毠茈娪镜碾娪緢D譜及檢測峰自動分析，結(jié)合marker分析片段的長度，根據(jù)片段長度判斷腹瀉病毒的種類；該檢測體系從樣本處理到分析出結(jié)果近3 h，相比其他檢測手段具有高通量、低成本、臨床操作性強及檢測效率高的特點，但實驗室需配備凝膠電泳儀及培訓(xùn)后的專業(yè)檢測人員。

185例臨床腹瀉樣本經(jīng)本體系檢出132例病毒感染，陽性率達71.35%，5種腹瀉病毒均檢出；單病毒感染及復(fù)合病毒感染分別為101例及31例，以單病毒感染為主；腹瀉病毒檢出情況包括RV A感染105例、Adv 22例、SV 15例、NoV G2 11例和HAstV 10例，主要集中在輪狀病毒和腺病毒，與Thongprachum等研究結(jié)果基本一致[2]。