周萬(wàn)青，宋熙晶，生媛，姜飛，徐杰，張之烽，沈瀚

(1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院a. 檢驗(yàn)科，b. 醫(yī)院感染管理科，南京 210008；2. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京210009；3. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州221002；4. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，江蘇蘇州 215006)

利奈唑胺(linezolid)是一種人工合成的噁唑烷酮類抗菌藥物，2000年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于治療革蘭陽(yáng)性球菌引起的感染，并對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和腸球菌等有較好的治療效果[1]。利奈唑胺為細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，作用于翻譯系統(tǒng)的起始階段，抑制mRNA與核糖體連接，從而影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和細(xì)菌生長(zhǎng)。

凝固酶陰性葡萄球菌分布廣泛，大多無(wú)致病性。隨著各類廣譜抗菌藥物的使用和各種侵襲性操作，該類菌的臨床分離率和耐藥性逐年升高[2]。而耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌檢出率不斷增加且呈地區(qū)性播散[3-4]。造成菌株對(duì)利奈唑胺耐藥的主要機(jī)制是23S rRNA第V功能區(qū)突變、cfr基因?qū)颂求w大亞基23S rRNA發(fā)生甲基化作用、optrA基因、核糖體蛋白L3、L4位點(diǎn)突變[5]。南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2012—2014年發(fā)現(xiàn)存在利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌的院內(nèi)播散流行，并發(fā)現(xiàn)cfr合并23S rRNA突變是造成菌株耐藥的決定因素[6]。而對(duì)于利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌在江蘇省內(nèi)的流行性及耐藥決定基因尚缺乏數(shù)據(jù)，為此，本研究收集2017—2018年江蘇省3家三級(jí)甲等醫(yī)院臨床及環(huán)境分離的38株利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌，進(jìn)行耐藥機(jī)制和同源性的分析。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源及鑒定 收集2017—2018年南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院(GLH)、徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(XYFY)和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院(SDFY)臨床分離利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌32株，各單位菌株數(shù)分別為21株、10株和1株，樣本來(lái)源分別為血液30例，腦脊液和分泌物各1例；采集同期南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院ICU病區(qū)(GLHICU)環(huán)境樣本并分離獲得利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌6株。所有菌株經(jīng)菌落形態(tài)、革蘭染色、凝固酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫試驗(yàn)鑒定為凝固酶陰性葡萄球菌，后經(jīng)Vitek 2 Compact GP鑒定板卡、質(zhì)譜和16S rRNA基因測(cè)序確認(rèn)，其中頭狀葡萄球菌32株，人葡萄球菌4株，表皮葡萄球菌1株，緩慢葡萄球菌1株。cfr陽(yáng)性頭狀葡萄球菌、糞腸球菌ATCC 29212及金黃色葡萄球菌ATCC 25923均為本院微生物室保存菌株。

1.2主要試劑及儀器 2×Taq Mix(DBI公司)，PCR引物由上海生工公司合成，Vitek 2 Compact及配套GP鑒定卡、GP67藥敏板卡以及利奈唑胺E-Test試紙條(法國(guó)生物梅里埃公司)，脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)瓊脂糖(Bio-Rad公司)，SmaⅠ內(nèi)切酶(Fermentas公司)，十二烷基肌氨酸鈉、EDTA、Tris、溶葡萄球菌素、溶菌酶(上海生工生物公司)，蛋白酶K(Merck公司)，Qiagen DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，Lambda Ladder PFG marker(NEW ENGLAND BioLabs)；PCR擴(kuò)增儀(PE公司)，CHEF Mapper XA電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3藥敏試驗(yàn) 用Vitek 2 Compact及配套GP67藥敏卡對(duì)菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，并采用E-test紙條法測(cè)定菌株對(duì)利奈唑胺的最低抑菌濃度(MIC)，所有結(jié)果判讀基于CLSI 2019判定標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.4細(xì)菌DNA的提取及PCR擴(kuò)增 采用煮沸法提取菌株DNA作為PCR模板。根據(jù)文獻(xiàn)[3, 8-9]合成23S rRNA第V功能區(qū)基因、cfr基因及optrA基因引物，見(jiàn)表1。PCR體系20 μL，包括2×Taq Mix 10 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 靶基因PCR引物序列及產(chǎn)物大小

1.5PFGE 取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)14～18 h的菌株菌落均勻懸浮于已配制的PIV buffer(1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4)中，調(diào)節(jié)濃度至4.0麥?zhǔn)蠞舛葐挝?，?00 μL菌液與200 μL包埋膠[0.32 g PFGE電泳瓊脂糖+20 mL TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0)]混合至EP管中后進(jìn)行澆孔灌模，成型后移至3 mL Lysis buffer[100 mmol/L EDTA，6 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%十二烷基肌氨酸鈉pH7.4，0.2%去氧膽酸鈉(內(nèi)含25 μL 25 mg/L溶菌酶和10 μL 100 mg/L溶葡萄球菌素)]中37 ℃過(guò)夜；棄去過(guò)夜的Lysis buffer，加入含150 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的3 mL ESP buffer(0.5 mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，pH8.0)，56 ℃過(guò)夜；用預(yù)熱的TE 10∶1洗膠塊6次；用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ(30 U)30 ℃酶切消化基因組DNA，上梳子、澆板完成后，使用CHEF-Mapper XA系統(tǒng)進(jìn)行電泳分析，設(shè)置參數(shù)電壓6 V/cm、電泳溫度14 ℃、夾角120°，21 h，脈沖為1～30 s，EB染色20～30 min，使用GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。最終結(jié)果以Tenover為標(biāo)準(zhǔn)[10]。

2 結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果 38株菌對(duì)利奈唑胺、青霉素和苯唑西林均耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素均敏感；對(duì)克林霉素、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥率在95%以上；臨床分離株對(duì)奎奴普丁-達(dá)福普汀、四環(huán)素和利福平較敏感，環(huán)境分離株對(duì)左氧氟沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑均耐藥；頭狀葡萄球菌除對(duì)四環(huán)素和復(fù)方磺胺甲噁唑有較高敏感，對(duì)其余常規(guī)藥物耐藥率達(dá)75%以上，人葡萄球菌、表皮葡萄球菌和緩慢葡萄球菌均對(duì)慶大霉素敏感。見(jiàn)表2。利奈唑胺MIC分布為12～256 mg/L，其中256 mg/L及以上31株，12 mg/L 3株，64 mg/L 3株和24 mg/L 1株。

表2 臨床和環(huán)境菌株常規(guī)藥物耐藥率(%)

注：ERY，紅霉素；QDA，奎奴普丁-達(dá)福普??；CLI，克林霉素；LVX，左氧氟沙星；TCY，四環(huán)素；SXT，復(fù)方磺胺甲噁唑；CIP，環(huán)丙沙星；RIF，利福平；MFX，莫西沙星；GEN，慶大霉素；P，青霉素；OXA，苯唑西林；VA，萬(wàn)古霉素；LZD，利奈唑胺；CoNS,凝固酶陰性葡萄球菌。

2.2耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 PCR結(jié)果顯示31株菌攜帶cfr基因(82%)，其中頭狀葡萄球菌27株、人葡萄球菌2株、表皮葡萄球菌和緩慢葡萄球菌各1株；23S rRNA第V功能區(qū)基因擴(kuò)增均陽(yáng)性，35株菌株檢出G2576T突變，其中2株人葡萄球菌同時(shí)檢出G2576T和C2319T突變，另在表皮葡萄球菌和人葡萄球菌檢出C2319T突變各1株，1株緩慢葡萄球菌未獲成功測(cè)序；所有菌株均未檢測(cè)出optrA基因。部分菌株的基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：1，陰性對(duì)照；2，optrA基因；3—5，23S rRNA V區(qū)；6—8，cfr基因；M，100 bp DNA Ladder marker。

圖1部分菌株的耐藥基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

2.3PFGE結(jié)果分析 32株頭狀葡萄球菌PFGE具有高度的相似性，均為同一個(gè)克隆株，可分為4個(gè)不同的亞克隆，分別為A1、A2、A3和A4，菌株數(shù)分別為4株、26株、1株和1株。見(jiàn)圖2。4株人葡萄球菌分別來(lái)自GLH臨床分離株(1株)、XYFY臨床分離株(2株)和GLH環(huán)境分離株(1株)，其PFGE電泳圖譜顯示為同一克隆，其中GLH臨床分離株和GLH環(huán)境分離株為AA1亞型，XYFY臨床分離株分別為AA2和AA3亞型。見(jiàn)圖3。

注：M，Lambda Ladder PFG marker；1—4、11，GLH臨床分離株；5—8，XYFY臨床分離株；9-10，GLH環(huán)境分離株；12，SDFY臨床分離株。泳道1-12菌株克隆分型分別為A1、A2、A2、A3、A4、A2、A2、A2、A2、A2、A2、A3。

圖2部分利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌菌株P(guān)FGE分析

注：M，Lambda Ladder PFG marker；1—4，人葡萄球菌分離株；5，表皮葡萄球菌分離株；6，緩慢葡萄球菌分離株。泳道1—4人葡萄球菌克隆分型分別為AA1、AA2、AA3、AA1。

圖3其他利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌PFGE分析

3 討論

利奈唑胺自2007年在中國(guó)上市以來(lái)，我國(guó)多個(gè)城市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了利奈唑胺的耐藥株，并以凝固酶陰性葡萄球菌為主[11]。本研究收集江蘇地區(qū)利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌臨床分離株32株，并對(duì)GLHICU環(huán)境采樣獲得的6株耐藥菌株進(jìn)行檢測(cè)分析。臨床檢出耐藥菌株中以血流分離最高，達(dá)93.8%(30/32)，這與國(guó)內(nèi)數(shù)據(jù)具有相似性[11-12]。藥敏結(jié)果顯示，38株耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌均對(duì)青霉素和苯唑西林耐藥，對(duì)克林霉素、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥率均等于或高于95%，呈現(xiàn)多重耐藥；環(huán)境分離株對(duì)左氧氟沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑均耐藥；頭狀葡萄球菌除對(duì)四環(huán)素和復(fù)方磺胺甲噁唑有較高敏感，其他檢測(cè)藥物耐藥率均較高。38株菌均未出現(xiàn)萬(wàn)古霉素耐藥菌株，說(shuō)明萬(wàn)古霉素可用于治療耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌相關(guān)感染。

葡萄球菌利奈唑胺耐藥與23S rRNA突變或cfr基因共同介導(dǎo)有關(guān)[13]，這與本研究結(jié)果一致。本調(diào)查顯示cfr基因陽(yáng)性檢出率為81.6%(31/38)，與陳宏斌等[11]報(bào)道相似。陽(yáng)性檢出菌種以頭狀葡萄球菌為主，占27株，其次為人葡萄球菌2株、表皮葡萄球菌和緩慢葡萄球菌各1株。臨床菌株中存在人葡萄球菌和頭狀葡萄球菌各1株未檢出cfr基因，而環(huán)境菌株中僅1株頭狀葡萄球菌檢出該基因。由此可見(jiàn)，臨床菌株中cfr的攜帶率明顯高于環(huán)境菌株(93.8% vs 16.7%)。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道cfr可能存在于2種不同質(zhì)粒，分別為pRM01和pHK01[11]。江蘇地區(qū)耐藥菌株中cfr基因的定位和可能傳播機(jī)制尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。除cfr基因外，所有菌株23S rRNA第V功能區(qū)基因擴(kuò)增均陽(yáng)性，35株菌株檢出G2576T突變，其中2株菌(人葡萄球菌)同時(shí)檢出G2576T和C2319T突變，另在表皮葡萄球菌和人葡萄球菌檢出C2319T突變各1株，1株緩慢葡萄球菌未獲成功測(cè)序。23S rRNA第V功能區(qū)G2576T突變是介導(dǎo)陽(yáng)性球菌利奈唑胺耐藥主要決定因素[5]。38株菌中未檢出optrA基因，有文獻(xiàn)指出optrA基因在腸球菌檢出率高[13]。GLH對(duì)2014—2017年度臨床分離腸球菌利奈唑胺耐藥調(diào)查顯示，optrA是主要介導(dǎo)基因[14]。關(guān)于葡萄球菌攜帶optrA基因只在動(dòng)物源中有報(bào)道，optrA基因是繼cfr基因報(bào)道后的第2個(gè)可轉(zhuǎn)移的利奈唑胺耐藥基因，易通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，其能否通過(guò)葡萄球菌實(shí)現(xiàn)人畜之間的傳播仍需考證[13]。

本研究38株凝固酶陰性葡萄球菌包括32株頭狀葡萄球菌，其PFGE具有高度的相似性，均為同一個(gè)克隆株，4株人葡萄球菌為同一克隆株，可見(jiàn)3家醫(yī)院間流行的利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌存在克隆播散。而且，GLH環(huán)境分離株存在與臨床分離同一克隆的菌株。國(guó)外已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)耐藥菌株可在患者或院際間克隆傳播[15]，GLH 2012—2014年調(diào)查發(fā)現(xiàn)曾出現(xiàn)5株同一克隆株播散的利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌[6]。本次研究數(shù)據(jù)顯示與之前流行菌株也為同一克隆。由此可見(jiàn)，江蘇地區(qū)存在利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌的播散流行。醫(yī)院應(yīng)采取積極、嚴(yán)格的消毒和隔離等措施，加強(qiáng)感控和細(xì)菌耐藥性監(jiān)控力度，防止耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌克隆播散的加重。