郭琦，汪靜，曾潔，易喜連，周偉燕，趙海建，張傳寶

(1.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學中心 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心，北京100730；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院，北京100730)

堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)是臨床實驗室重要的檢測項目。國際臨床化學與檢驗醫(yī)學聯(lián)合會(IFCC)已于2002年、2011年分別發(fā)布了LDH和ALP的參考測量程序，并推薦廠家試劑校準品量值溯源至酶學參考系統(tǒng)。目前，酶校準品的制備有以下幾種方式:基因工程，如羅氏、和光等；提取動物組織，如貝克曼等；還有直接使用人血清制備，如德賽等。

據(jù)國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心(NCCL)2012—2016年正確度驗證計劃結果顯示，以3.23%作為精密度的評價標準時，ALP精密度合格率超過85%；然而，以6.72%為偏倚評價標準時，ALP偏倚的通過率小于50%，其中貝克曼的偏倚通過率為25.0%～61.8%、羅氏的偏倚通過率為7.2%～27.5%，不同實驗室的檢測結果差異較大[1]。酶學項目常規(guī)方法的量值溯源通過校準實現(xiàn)，校準需要注意校準品量值溯源的有效性，其中復溶方式會對量值溯源產(chǎn)生一定影響。本研究主要考察不同酶校準品復溶方式對檢測結果的影響。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1血清樣品 21份單人份血清樣品(HIV抗體陰性，每份0.5 mL)由北京醫(yī)院提供。

1.1.2試劑 貝克曼(Beckman)、羅氏(Roche)、德賽(Diasys)、和光(Wako)的ALP和LDH活性測定試劑盒及其配套校準品，分別用B、R、D、W代表。試劑與校準品相關信息見表1。

表1 試劑盒和校準品信息

1.1.3校準品 用移液管分別準確吸取5 mL去離子水加入3個校準品瓶，顛倒校準品瓶3次，放置10 min，為消除瓶間差，將3個校準品瓶的校準液混合。然后重新分裝到3個校準品瓶中，其中2個校準品瓶在滾筒混勻器上(25 ℃)放置30 min。隨后取數(shù)支在4 ℃放置至少2 h，記為B0(貝克曼標準校準品)；另取數(shù)支放置于4 ℃ 0.5 h、1 h、3 h，分別記為B-4-0.5、B-4-1、B-4-3；另取數(shù)支放置于25 ℃ 0.5 h、1 h、2 h、3 h，分別記為B-25-0.5、B-25-1、B-25-2、B-25-3；從另一瓶未在滾筒混勻器上放置30 min的校準品瓶中取數(shù)支放置于4 ℃ 0.5 h、2 h，分別記為B-4-0.5-N、B-4-2-N。對于羅氏校準品，用移液管分別準確吸取3 mL去離子水加入3個校準品瓶，顛倒校準品瓶數(shù)次，將校準品瓶內(nèi)的校準液混合，取數(shù)支在25 ℃放置0.5 h，記為R0(羅氏標準校準品)；另取數(shù)支在4 ℃分別放置0.5 h、1 h、2 h、3 h，分別記為R-4-0.5、R-4-1、R-4-2、R-4-3；另取數(shù)支在25 ℃分別放置1 h、2 h、3 h，分別記為R-25-1、R-25-2、R-25-3。以同樣的方式復溶德賽和和光校準品，取數(shù)支放置在25 ℃ 2 h，記為D0(德賽標準校準品)，取數(shù)支放置在25 ℃ 0.5 h，記為W0(和光標準校準品)，其余放置在相應條件下，分別記為D-4-0.5、D-4-1、D-4-2、D-4-3、D-25-0.5、D-25-1、D-25-3，W-4-0.5、W-4-1、W-4-2、W-4-3、W-25-1、W-25-2、W-25-3。

1.1.4儀器 貝克曼AU5400、日立7180全自動生化分析儀，羅氏、德賽、和光方法均根據(jù)廠家推薦的參數(shù)設置表在日立7180全自動生化分析儀上設置參數(shù)。

1.2方法

1.2.1挑選待評校準品 分別用B0、R0、D0、W0對方法進行校準，檢測不同復溶方式下的貝克曼校準品ALP和LDH的值，包括B0、R0、D0、W0；每種校準品測定3次，同一廠家的校準品于一批內(nèi)完成測定，測定結果取均值并計算不同方式復溶的校準品與廠家標準校準品之間的偏倚。

1.2.2方法偏倚評價 由于B0校準品是按廠家推薦的標準復溶方式復溶，故以B0為校準品的檢測方法為比對方法；以B-25-2為校準品的檢測方法為待評方法1，以B-4-0.5-N為校準品的檢測方法為待評方法2，用上述3種方法測定21份單人血清，每個重復測定3次，結果取均值后使用最小二乘法估算簡單線性回歸的參數(shù)。根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)EP9-A3計算2種待評方法的絕對偏倚、相對偏倚和3個醫(yī)學決定水平處的偏倚。

1.3統(tǒng)計學分析 用WPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1不同方式復溶的校準品檢測結果 見表2。德賽、羅氏和和光的校準品ALP和LDH值在4 ℃和25 ℃下3 h內(nèi)不隨時間變化。其中貝克曼校準品B-25-2和B-4-0.5-N的ALP檢測結果偏倚較大，分別為5%和-4%。對于LDH未發(fā)現(xiàn)明顯偏倚。

表2 不同復溶方式下校準品與標準校準品測定值的偏倚(%)

注：“2 h，N”專指未在混勻器上混勻，且放置2 h的貝克曼校準品。

2.2對血清酶測定結果的影響 2種貝克曼校準品校準后測定21份血清ALP的待評方法斜率分別為0.973 3和1.041 4，截距分別為-1.823 4和1.790 1，R2均為0.999。由于本實驗結果的絕對偏倚和相對偏倚的分布不是正態(tài)分布，因此計算偏倚/相對偏倚的中位數(shù)；2種待評方法與比對方法相比，絕對偏倚分別為-4.00 U/L、7.17 U/L；相對偏倚分別為-3.92%、5.06%。由圖1可知，待評方法與比對方法間的相對偏倚較大，部分檢測結果的相對偏倚已超過來源于生物學變異的允許偏倚6.4%。2種待評方法測定ALP在3個醫(yī)學決定水平處的相對偏倚范圍分別為-5.71%～-3.13%、4.59%～7.12%，見表3。

圖1 2種待評方法與比對方法檢測結果的相對偏倚分布

表3 2種待評方法在3個醫(yī)學決定水平處的偏倚

3 討論

血清中的ALP包括了4種結構基因型：肝臟-骨骼-腎臟型、腸型、胎盤型和生殖細胞型[2]。不同的ALP最佳反應條件也不一樣，2017年的一篇文獻[3]指出人肝/骨型ALP的最佳pH值為10.2，胎盤型ALP的最佳pH值>10.4，其余來源ALP的最佳pH值<10.2。貝克曼校準品中的ALP來自于牛腸黏膜，羅氏校準品的ALP來自于基因工程合成的人胎盤型ALP，德賽的ALP來自于人血清，和光的ALP來自于基因工程合成的肝型ALP。這說明不同廠家的試劑需要使用配套校準品的必要性。貝克曼、德賽、羅氏、和光均聲稱其ALP檢測原理是基于IFCC建議的方法。在pH=10.4條件下，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)作為磷酸酯受體，通過測定磷酸對硝基苯(pNPP)到對硝基苯酚(pNP)的轉化率來判斷ALP的活性[4]。德賽、羅氏的ALP試劑1的pH值分別為10.4、10.44。貝克曼和和光的ALP試劑說明書未寫明pH值。

除了必須使用配套的試劑和校準品以外，校準品的復溶方式對檢測也有極大的影響,2014年林素平等[5]主要探討試劑用水量取方式不同對干粉校準品復溶后測量系統(tǒng)的影響。本實驗主要探討復溶方式不同對校準品復溶后測定結果的影響，結果表明,應用相同的試劑和儀器,3種校準品(B-25-3、B-25-2、B25-4-0.5-N)測定的臨床血清ALP均值比較,平均偏倚高達5.07%,接近生物學變異率中推薦的偏倚指標6.4%。

在復溶干粉校準品時，酶蛋白結構的完全展開和酶活性的恢復需要一定的時間和條件。在其尚未完全展開恢復活性時，其實測值低于校準品的標示值，如果用此校準品對方法進行校準，那么得到的檢測結果就會相對偏高。本實驗中的待評方法2所用校準品未按照廠家推薦的復溶方法操作，沒有經(jīng)過30 min的滾筒混勻器且只放置了半小時就進行檢測，所得結果大幅偏高，其原因可能是因為未經(jīng)完全混勻，導致物質在溶液內(nèi)分布不均。而待評方法1中的校準品是在25 ℃下放置2 h后進行檢測，檢測結果相對偏低，其原因可能是酶蛋白在溫度相對高的環(huán)境下，展開得更加完全。所以復溶校準品時應注意保證與其定值時的復溶條件盡量一致。

目前歐洲已強制要求醫(yī)學實驗室的酶學檢測方法溯源至參考方法。本實驗中的4個廠家的檢測系統(tǒng)在其說明書上均聲稱其校準品溯源至IFCC參考方法，但事實上，由于廠家為了自動化分析的需要或生產(chǎn)過程等原因，會有意無意地對IFCC推薦的參考方法作不同程度的改動，因而實際上各廠家的試劑盒仍存在一定差異[6]。另外各廠家使用的校準品原料也大不相同。本次實驗中4個廠家的校準品均不相同，只有貝克曼的ALP為非人源性。實驗結果發(fā)現(xiàn)貝克曼校準品在針對ALP項目時不同復溶方式對檢測結果有影響。對LDH項目，尚未發(fā)現(xiàn)類似影響；針對其他廠家的校準品，也未發(fā)現(xiàn)類似影響，這可能與貝克曼校準品中ALP的特殊結構有關。此外，結合2012—2016年ALP正確度評價結果分析[1]，校準品復溶不規(guī)范可能是貝克曼的偏倚通過率偏低的原因之一。

正確復溶校準品是實施準確檢測的前提。如實驗室工作人員按照不同的方式復溶校準品再進行檢測，偏倚將會更大，嚴重影響臨床醫(yī)生在診斷疾病時的判斷。所以臨床實驗室的工作人員在使用相關校準品時，應嚴格按照校準品說明書進行操作。