秦雅紅 張振剛 何維 劉海威 李晨 焦云根

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成是動(dòng)脈硬化的標(biāo)志性病變。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊，不穩(wěn)定斑塊又稱易損斑塊，易出現(xiàn)纖維帽潰瘍、斑塊破裂、斑塊內(nèi)出血，是心絞痛、心肌梗死、腦卒中的發(fā)生基礎(chǔ)。在動(dòng)脈管腔變窄或斑塊侵蝕、破裂引發(fā)急性事件之前，動(dòng)脈粥樣硬化通常保持“臨床沉默”[1-2]。對(duì)易損斑塊的早期準(zhǔn)確評(píng)估及有效干預(yù)具有重要意義。

目前，臨床上用于早期識(shí)別易損斑塊的常見方法有血管造影、放射性核素顯像、多層螺旋CT、核磁共振、彩色多普勒超聲、光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)(OCT)等[3]，但各有利弊，且部分項(xiàng)目難以普及。因此，臨床迫切需要新的非侵入性檢測(cè)手段來(lái)輔助識(shí)別不穩(wěn)定斑塊高危人群。血液循環(huán)中斑塊易損性相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)比其他檢測(cè)方法敏感性高，操作性強(qiáng)，在預(yù)測(cè)斑塊穩(wěn)定性中具有重要意義。經(jīng)典的反映斑塊穩(wěn)定性的血清標(biāo)志物有C反應(yīng)蛋白(CRP)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、纖維蛋白原(Fib)、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(LP-PLA2)、同型半胱氨酸(Hcy)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)其他斑塊穩(wěn)定性標(biāo)志物，如CD40配體(CD40L)、妊娠相關(guān)蛋白-A(PAPP-A)、血清凝集素樣氧化型低密度脂蛋白-1(LOX-1)、骨橋蛋白(OPN)、人軟骨糖蛋白-39(YKL-40)、組織蛋白酶(Cat)S等。

1 酶解作用標(biāo)志物

1.1 MMP

MMP是一組鋅依賴性蛋白酶，廣泛表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，特別是在富含巨噬細(xì)胞的粥樣斑塊區(qū)域高表達(dá)，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和重構(gòu)，降解血管成分[4]。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由纖維帽和脂質(zhì)核心組成，纖維帽主要由含有大量膠原纖維的細(xì)胞外基質(zhì)、平滑肌細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞組成；脂質(zhì)核心由巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和ECM組成。對(duì)尸檢的295個(gè)冠狀動(dòng)脈硬化斑塊進(jìn)行研究，結(jié)果顯示95%的斑塊破裂發(fā)生在斑塊帽厚度<65 μm的病變中，薄的纖維帽容易導(dǎo)致斑塊破裂、血小板活化和隨后的血栓形成。Hu等[4]分析了200例患者頸動(dòng)脈斑塊性質(zhì)與血清MMP-1、MMP-3、MMP-12水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)易損斑塊組的MMP-1、MMP-3、MMP-12水平明顯高于無(wú)斑塊組和穩(wěn)定斑塊組，提示其可能促進(jìn)斑塊從穩(wěn)定狀態(tài)向易損狀態(tài)轉(zhuǎn)化，增加斑塊的不穩(wěn)定性。除此之外，MMP家族其他成員如膠原酶(MMP-8和MMP-13)、明膠酶(MMP-2和MMP-9)、基質(zhì)蛋白酶(MMP-7)以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3)等也被證明與斑塊穩(wěn)定性相關(guān),其中MMP-2、-3、-9、-12、-13、-14以及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3在不穩(wěn)定斑塊中發(fā)揮作用，通過降解各種ECM成分，削弱纖維帽結(jié)締組織，從而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定[5]。MMP在促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成中的作用是肯定的，但需要進(jìn)一步研究其在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的臨床意義。

1.2 PAPP-A

PAPP-A是一種高分子量的鋅結(jié)合金屬蛋白酶，是心腦血管疾病和易損斑塊的候選標(biāo)志物。PAPP-A最早發(fā)現(xiàn)于妊娠婦女的血漿中，后來(lái)證實(shí)除生殖組織(卵巢、子宮內(nèi)膜、胎盤組織、睪丸)以外，腎臟、結(jié)腸、骨髓等組織也可表達(dá)；PAPP-A既可由胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌，也可由骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪組織等分泌[6-7]。

PAPP-A作為不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生物標(biāo)志物，最初是由Bayes-Genis等[8]提出的。作為MMP家族的一員，PAPP-A具有該類蛋白酶的共同特點(diǎn)，即通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、削弱纖維帽而破壞斑塊穩(wěn)定性[9]。近期研究指出，PAPP-A通過釋放胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1，促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成[6]。IGF軸包括IGF、IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)、IGFBP水解酶，PAPP-A發(fā)揮IGFBP水解酶作用，可水解IGFBP-2、-4、-5等蛋白，但其功能與IGFBP-4密切相關(guān)。IGFBP-4是PAPP-A在易損斑塊中水解的主要底物，介導(dǎo)局部IGF釋放，IGF-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化、趨化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吸收低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子，從而加速纖維帽的破裂和脂質(zhì)核心的擴(kuò)大；此外，IGF-1也參與血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，引起血管損傷，加重管腔狹窄[10]。Lodh等[10]證實(shí)PAPP-A水平與高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)顯著相關(guān)，PAPP-A對(duì)預(yù)測(cè)易損斑塊的存在不但有較高特異性和敏感性，而且PAPP-A水平不受感染或任何潛在炎癥的影響，其血清水平是預(yù)測(cè)斑塊易損性的良好指標(biāo)，也是臨床上可有效預(yù)測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的生物標(biāo)志物。值得注意的是，ACS患者在靜脈注射肝素時(shí)會(huì)出現(xiàn)血清PAPP-A水平迅速而短暫地升高[11]。因此，在研究血清PAPP-A水平時(shí)需排除人為因素。

1.3 Cat S

Cat也稱為溶酶體半胱氨酸蛋白酶，最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞溶酶體中，內(nèi)吞降解胞內(nèi)“無(wú)功能”的蛋白質(zhì)[12]。目前，已鑒定出11種人Cat，Cat S是在人動(dòng)脈粥樣硬化病變中最早發(fā)現(xiàn)的Cat之一，其在動(dòng)脈粥樣硬化病變中的作用機(jī)制也已明確。

正常人動(dòng)脈很少表達(dá)或不表達(dá)Cat S，但在早期和晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中均有Cat S表達(dá)，位于血管內(nèi)膜、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維帽以及彈性蛋白等[13]。在致動(dòng)脈粥樣硬化性低密度脂蛋白受體缺陷(LDLR-/-)小鼠中，Cat S缺乏(Cat S-/-)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著減少，彈性蛋白酶活性和彈性蛋白斷裂數(shù)量顯著降低，且斑塊中巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、CD4+細(xì)胞和膠原蛋白水平也顯著降低[13]。將正常人的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與促炎性細(xì)胞因子共培養(yǎng)，可見內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞Cat S水平明顯增加，說明炎性環(huán)境能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞Cat S表達(dá)增加，Cat S通過降解細(xì)胞外彈性蛋白和膠原蛋白引起斑塊不穩(wěn)定[14]。曾慶淦等[15]研究缺血性腦卒中患者Cat S與斑塊性質(zhì)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清Cat S水平在健康組、穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組中依次升高，提示Cat S能預(yù)測(cè)斑塊不穩(wěn)定和破裂，在一定程度上可作為評(píng)估缺血性疾病的血清標(biāo)志物。Gu等[16]也得出相似結(jié)論，在不穩(wěn)定性心絞痛患者中，較高血漿Cat S水平表明存在易損斑塊。因此，Cat S加速了穩(wěn)定斑塊向不穩(wěn)定斑塊的轉(zhuǎn)變，未來(lái)可能作為一種預(yù)測(cè)性指標(biāo)用于臨床。

2 促炎性細(xì)胞因子標(biāo)志物

2.1 MCP-1

MCP-1也稱為趨化因子配體2(CCL2)，是調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的關(guān)鍵分子。MCP-1由心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及單核細(xì)胞等產(chǎn)生，此外，各種細(xì)胞因子、代謝因子、高脂血癥和氧化應(yīng)激等也可促使MCP-1產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)MCP-1參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病[17]。

MCP-1與其受體CCR2結(jié)合，會(huì)將單核細(xì)胞募集到動(dòng)脈粥樣硬化的炎性部位，促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞的積聚和浸潤(rùn)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxLDL)形成泡沫細(xì)胞，并導(dǎo)致脂質(zhì)沉積，從而加速動(dòng)脈硬化斑塊的形成和性質(zhì)變化[18]。

在動(dòng)脈粥樣硬化易感的LDLR-/-小鼠中，MCP-1基因缺失可顯著減少飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣斑塊形成，在CCR2缺陷小鼠中也得到了類似結(jié)果，載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠中CCR2基因的靶向破壞導(dǎo)致動(dòng)脈巨噬細(xì)胞積聚和動(dòng)脈粥樣斑塊的顯著減少[17]。習(xí)艷兵等[19]發(fā)現(xiàn)血MCP-1水平與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)，且隨著斑塊臨床分級(jí)的升高，血MCP-1水平逐漸升高，提示MCP-1反映斑塊易損性。朱玉潔等[20]對(duì)38例頸動(dòng)脈狹窄且伴有斑塊的患者行頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)，取動(dòng)脈組織并對(duì)斑塊行HE染色，通過免疫組織化學(xué)方法定性、定位檢測(cè)MCP-1表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)患者血清MCP-1水平，結(jié)果顯示MCP-1在不穩(wěn)定斑塊組織中表達(dá)上調(diào)，且有不穩(wěn)定斑塊的患者血清MCP-1水平更高，這提示MCP-1可能成為反映斑塊穩(wěn)定性的指標(biāo)之一。

2.2 LOX-1

LOX-1屬于E類清道夫受體，是由273個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅱ型膜表面糖蛋白。Sawamura等[21]最早將LOX-1定義為內(nèi)皮細(xì)胞oxLDL的主要受體，隨后發(fā)現(xiàn)LOX-1也在心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、平滑肌細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)。

內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，內(nèi)皮細(xì)胞受損可增強(qiáng)黏附分子表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，隨后單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，吞噬oxLDL形成泡沫細(xì)胞，這一環(huán)節(jié)主要由LOX-1介導(dǎo)[22]。其次，LOX-1可通過誘導(dǎo)MMP的表達(dá)而加重ECM的降解和重構(gòu)，基質(zhì)降解增加可削弱管壁的機(jī)械抵抗力，使其在血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化時(shí)更易破裂[23]。Ishino等[23]分析了家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性與LOX-1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LOX-1在纖維肌帽較薄(<100 μm)的粥樣硬化斑塊中表達(dá)增加，在巨噬細(xì)胞豐富的脂質(zhì)核心區(qū)表達(dá)更為明顯。

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成早期，人類內(nèi)皮細(xì)胞中即可檢測(cè)到LOX-1，而在無(wú)粥樣斑塊的動(dòng)脈中，LOX-1表達(dá)極低；與斑塊穩(wěn)定的患者相比，不穩(wěn)定斑塊患者的LOX-1的表達(dá)明顯上調(diào)[24]。在動(dòng)物模型中，LOX-1在C57BL/6小鼠的健康內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較低，而在喂食高脂肪飼料的ApoE-/-小鼠中表達(dá)上調(diào)；LOX-1基因缺失導(dǎo)致LDLR-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣斑塊顯著減少，而在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)LOX-1可促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[25]。這些研究提示LOX-1是動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊進(jìn)展的關(guān)鍵因素，可作為動(dòng)脈斑塊易損性的重要標(biāo)志物。

2.3 CD40L

CD40L是由261個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅱ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子(TNF)超家族中的一個(gè)共刺激分子，也稱為CD154，可表達(dá)于各種造血細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、血小板等)和非造血細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)，但目前認(rèn)為CD40L主要是CD4+細(xì)胞和血小板的功能標(biāo)志物[26-27]。儲(chǔ)存在血小板中的CD40L在血小板表面表達(dá)后立即活化，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，其細(xì)胞外成分被酶解并從細(xì)胞膜分離入血，產(chǎn)生可溶性CD40L(sCD40L)，sCD40L是一種促炎性細(xì)胞因子，參與全身炎性反應(yīng)[26]。

Matthies等[28]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、高膽固醇血癥和不穩(wěn)定心絞痛患者的血清CD40L水平較高。有研究指出，動(dòng)脈粥樣硬化病變部位表達(dá)有豐富的CD40和CD40L，CD40L可刺激內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，促進(jìn)oxLDL的吸收及泡沫細(xì)胞形成，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；此外，CD40還可通過誘導(dǎo)MMP的表達(dá)促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂[29]。Han等[26]對(duì)65例頸動(dòng)脈斑塊患者行高分辨率磁共振成像研究，結(jié)果顯示血清sCD40L水平與斑塊中脂質(zhì)成分有明顯關(guān)聯(lián)，而與狹窄程度無(wú)關(guān)，其水平升高可提示斑塊受損或破裂。Henn等[30]也證明血清sCD40L水平升高能加重動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)，降低斑塊穩(wěn)定性。朱漢華等[31]對(duì)304例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者行冠狀動(dòng)脈CT血管造影(CTA)檢查，發(fā)現(xiàn)有易損斑塊的患者血清sCD40L水平顯著高于穩(wěn)定斑塊組和對(duì)照組，sCD40可作為易損斑塊的血清炎性標(biāo)志物。

2.4 OPN

OPN也稱為早期T淋巴細(xì)胞激活因子-1，屬于磷酸化糖蛋白，最早發(fā)現(xiàn)OPN基因主要在骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，隨后證實(shí)其在免疫細(xì)胞等中也有表達(dá)，巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的OPN被認(rèn)為是動(dòng)脈硬化斑塊中OPN的主要來(lái)源[32]。研究表明，OPN能通過其促炎性細(xì)胞因子作用參與不穩(wěn)定斑塊形成，OPN不但可介導(dǎo)Th1免疫，觸發(fā)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移、單核-巨噬細(xì)胞活化，還可誘導(dǎo)MMP的釋放和動(dòng)脈硬化斑塊內(nèi)的血管生成，導(dǎo)致纖維帽降解和出血，加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，促使不穩(wěn)定斑塊的形成[33]。

在高脂喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠中，過表達(dá)OPN可加快動(dòng)脈粥樣硬化病變形成，而同時(shí)降低ApoE和OPN的表達(dá)能抑制雌性小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[33]。Carbone等[32]在研究OPN與頸動(dòng)脈斑塊易損性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在有癥狀和無(wú)癥狀的患者中，OPN水平與斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量和MMP-9水平呈正相關(guān)，且共定位于炎性部位，有癥狀患者血清OPN水平較無(wú)癥狀的患者增加4倍，OPN高水平患者的斑塊更不穩(wěn)定，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平更低。血管內(nèi)超聲顯示穩(wěn)定型心絞痛患者斑塊鈣化程度比ACS患者更廣泛。Carbone等[32]還證實(shí)低回聲易破裂斑塊鈣化程度較高回聲斑塊更低，提示動(dòng)脈斑塊中的鈣沉積可增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，OPN作為鈣化抑制因子，通過下調(diào)斑塊鈣化水平促使斑塊不穩(wěn)定。然而，OPN在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用仍有爭(zhēng)議。冠狀動(dòng)脈鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化的特征，電子束計(jì)算機(jī)斷層掃描對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化斑塊的定量評(píng)估可強(qiáng)烈預(yù)測(cè)ACS風(fēng)險(xiǎn)[34]。

2.5 YKL-40

急性期蛋白YKL-40又稱幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白1，是一種無(wú)幾丁質(zhì)酶活性的炎性糖蛋白，由巨噬細(xì)胞在分化晚期表達(dá)，其他來(lái)源包括血管平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等[35]。

YKL-40與動(dòng)脈粥樣硬化形成、斑塊不穩(wěn)定的關(guān)系已被證實(shí)，YKL-40通過促使損傷內(nèi)皮細(xì)胞趨化、黏附和遷移，參與早期動(dòng)脈粥樣硬化形成[35]。Baran等[35]證實(shí)早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊巨噬細(xì)胞中YKL-40水平升高，高表達(dá)YKL-40的巨噬細(xì)胞能加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展；其次，在內(nèi)皮功能損傷時(shí)，YKL-40參與血管生成、細(xì)胞遷移和組織重構(gòu)，使斑塊更易出現(xiàn)腐蝕出血；此外，YKL-40還通過影響透明質(zhì)酸的合成以及MMP-9的表達(dá)促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成。Wu等[36]研究表明，YKL-40過表達(dá)可預(yù)測(cè)CagA+幽門螺桿菌感染者的頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性，與CRP相比，YKL-40能更準(zhǔn)確地反映斑塊穩(wěn)定性，預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生及預(yù)后。雷莉等[18]在研究H型高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者血清炎性標(biāo)志物與斑塊性質(zhì)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，YKL-40水平與斑塊分級(jí)呈正相關(guān)，隨著斑塊不穩(wěn)定性增加，血清YKL-40水平呈上升趨勢(shì)，其通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞、降低斑塊穩(wěn)定性、促進(jìn)局部血栓形成等參與臨床事件發(fā)生。

3 小結(jié)

近年來(lái)，對(duì)缺血性疾病的認(rèn)識(shí)已逐漸從管腔狹窄程度轉(zhuǎn)向斑塊生物學(xué)特點(diǎn)。血清斑塊穩(wěn)定性標(biāo)志物檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)、易操作的手段，可識(shí)別高危斑塊(高危人群)以指導(dǎo)臨床早期預(yù)防性治療。無(wú)創(chuàng)性血清標(biāo)志物檢測(cè)聯(lián)合影像學(xué)檢查早期共同評(píng)估斑塊穩(wěn)定性，將為動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病的預(yù)防性治療提供新的思路。