嚴(yán) 毅, 許抗抗, 楊 洪, 胡大鳴, 楊文佳

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025;2. 貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院, 貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550005;3. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院, 貴陽 550025; 4. 貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 貴陽 550025)

煙草甲Lasiodermaserricorne隸屬于鞘翅目(Coleoptera)竊蠹科(Anobiidae)，是煙草、糧食、中藥材、茶葉等儲(chǔ)藏期害蟲的優(yōu)勢種，其發(fā)生危害具有較強(qiáng)的隱藏性(Lietal., 2009)。同時(shí)由于煙草甲繁殖力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特性，其危害愈演愈烈，對(duì)多種儲(chǔ)藏物造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Imai and Masuda, 2017; Yangetal., 2019)。目前，煙草甲的防治主要以化學(xué)熏蒸為主，但化學(xué)藥劑的長期不合理使用不僅導(dǎo)致其抗藥性發(fā)展迅速，由此帶來的食品安全和環(huán)境保護(hù)等問題也日益突出(Hori, 2003; Hironakaetal., 2017)。甲酸乙酯常溫下為無色液體，是一種防治倉儲(chǔ)害蟲的新型熏蒸劑，具有殺蟲快、毒性低、無殘留等特點(diǎn)，并且多種儲(chǔ)藏物會(huì)自然產(chǎn)生甲酸乙酯，因此該藥劑的使用不會(huì)對(duì)儲(chǔ)藏物的品質(zhì)造成影響(Nicholas and Ebert, 2006)。自2002年登記注冊(cè)以來，甲酸乙酯被廣泛應(yīng)用于谷蠹Rhyzoperthadominica, 赤擬谷盜Triboliumcastarteum, 菜豆象Acanthoscelidesobtectus, 嗜卷書虱Liposcelisbostrychophila和花斑皮蠹Trogodermavariabile等倉儲(chǔ)害蟲的防治，研究證實(shí)其防控害蟲速效性優(yōu)于磷化氫，且毒性低于磷化氫，因此該熏蒸劑將有望成為磷化氫的替代品(唐培安等, 2007; 王云果等, 2008; 姚潔等, 2016)。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferases, GSTs, EC 2.5.1.18)是由多個(gè)基因編碼的超家族酶系，幾乎存在于所有的生物體內(nèi)(Sheehanetal., 2001; Lietal., 2007)。根據(jù)其同源性和底物特異性，可將昆蟲GSTs分為7個(gè)家族，包括Sigma, Omega, Zeta, Epsilon, Delta和Theta 6個(gè)已知家族和一個(gè)未知家族(Fengetal., 2001; 許抗抗等, 2017)。其中Epsilon和Delta是在昆蟲中特異存在的家族，主要通過催化多種外源和內(nèi)源的有毒疏水化合物與還原型的谷胱甘肽共軛親和，中和有毒物質(zhì)親電子中心，提高其水溶性，從而達(dá)到降低細(xì)胞毒性的目的(Agianianetal., 2003; Huetal., 2014)。研究表明，家蠶Bombyxmori的Epsilon家族GSTs不僅參與有毒物質(zhì)的解毒代謝過程，而且還具有抗氧化功能(Yuetal., 2008)。AgGSTe2蛋白參與了DDT在岡比亞按蚊Anophelesgambiae體內(nèi)的代謝，導(dǎo)致其抗藥性的產(chǎn)生(Ortellietal., 2003)。GSTe2,GSTe5和GSTe7基因在埃及伊蚊AedesaegyptiDDT抗性品系中過量表達(dá)，采用蛋白體外重組表達(dá)和RNA干擾(RNAi)技術(shù)，證明GSTe5蛋白可以有效代謝DDT，而GSTe2和GSTe7與溴氰菊酯和DDT的解毒有一定相關(guān)性(Lumjuanetal., 2011)。由此，可以看出Epsilon家族GSTs基因在昆蟲應(yīng)對(duì)外源化合物脅迫和解毒代謝過程中起著重要作用。目前有關(guān)Epsilon家族GSTs基因參與昆蟲對(duì)化學(xué)熏蒸劑解毒的分子機(jī)制研究較少。本研究在煙草甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得LsGSTe1基因的cDNA全長序列，利用qPCR技術(shù)分析了該基因在煙草甲不同發(fā)育階段、不同組織部位以及甲酸乙酯熏蒸脅迫后的表達(dá)特性，并采用RNAi技術(shù)研究其對(duì)甲酸乙酯的解毒特性。本研究初步探索了LsGSTe1在甲酸乙酯解毒過程中的作用，為新型分子靶標(biāo)殺蟲劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試煙草甲

煙草甲于2010年采自貴州省貴陽市(26°34′N, 106°41′E)，以中藥材當(dāng)歸Angelicasinensis為食料在人工氣候箱中連續(xù)飼養(yǎng)繁殖50代以上。氣候箱參數(shù)為：溫度28±1℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期0L∶24D。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, DNase, cDNA第1鏈合成試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit和DNA 2000 Marker均購自TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans5α, PCR試劑盒2×EasyTaq PCR SuperMix均購自全式金公司；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司；載體pGEM-T Easy Vector, qPCR試劑盒GoTaq? qPCR Master Mix均購自Promega公司；RNAi試劑盒TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit購自Thermo Scientific公司；熏蒸劑甲酸乙酯購自Aladdin公司(無水級(jí)，≥98%)。

1.3 煙草甲總RNA提取與cDNA第1鏈合成

根據(jù)MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書提取煙草甲的總RNA，利用NanoDrop 2000核酸蛋白濃度測定儀(Thermo Scientific公司)檢測RNA的濃度和純度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并利用DNase去除基因組DNA。選取OD260/OD230和OD260/OD280在1.8～2.2的RNA于-80℃保存?zhèn)溆?。使用PrimeScript? RT Reagent Kit合成cDNA第1鏈。

1.4 煙草甲LsGSTe1基因的克隆

根據(jù)煙草甲轉(zhuǎn)錄組獲得的1個(gè)Epsilon家族GST基因的Unigene片段，采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)全長驗(yàn)證引物(表1)擴(kuò)增該基因的開放閱讀框。PCR反應(yīng)體系： 2× Assembly Mix 25 μL, 上下游引物(20 μmol/L)各1 μL, cDNA模板2 μL, 加ddH2O補(bǔ)至總體積50 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照Gel Extraction Mini Kit說明書回收目的條帶，并連接至pGEM-T Easy載體，再轉(zhuǎn)化到Trans5α大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 序列分析

采用DNAMAN 6.0 (Lynnon Biosoft)對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行編輯和分析，推導(dǎo)的氨基酸序列采用BLAST工具(http:∥www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性比對(duì)分析。利用ProtParam (http:∥web.expasy.org/)和NetNGlys 1.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析編碼蛋白的理化性質(zhì)和N-糖基化位點(diǎn)。利用Prosite (http:∥prosite.expasy.org/)分析氨基酸的保守區(qū)域。經(jīng)過Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA 6.06軟件中的鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，替代模型為泊松模型，各分支均進(jìn)行1 000次的重復(fù)檢驗(yàn)(Tamuraetal., 2013)。

1.6 煙草甲LsGSTe1基因的時(shí)空表達(dá)

分別收集煙草甲低齡幼蟲(卵孵化后24 h內(nèi))、高齡幼蟲(4齡以上)、蛹(化蛹后48 h以上)、低齡成蟲(羽化后24 h內(nèi))和高齡成蟲(羽化后7 d)，每個(gè)蟲態(tài)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40頭試蟲。解剖煙草甲高齡幼蟲的表皮、中腸、脂肪體和馬氏管共4種組織，每種組織設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)分別解剖50頭試蟲。將上述材料經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，并按照1.3節(jié)方法分別提取所有樣品的總RNA并進(jìn)行cDNA制備。采用qPCR技術(shù)檢測煙草甲LsGSTe1基因的時(shí)空表達(dá)，以18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1。qPCR擴(kuò)增在CFX96TMReal-Time System實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad公司)中進(jìn)行，技術(shù)重復(fù)2次。反應(yīng)體系(20 μL): GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL, cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 7 μL?；靹蚝筝p微離心，擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5 min; 然后95℃變性15 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)；最后在60～95℃繪制熔解曲線，選取相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.98和擴(kuò)增效率(E)在90%～110%的引物備用。

表1 本研究使用的引物

下劃線為T7啟動(dòng)子序列。T7 promoter sequence is underlined.

1.7 甲酸乙酯脅迫后煙草甲LsGSTe1基因的表達(dá)

熏蒸處理參照廣口瓶密閉法(唐培安等, 2007)，用細(xì)毛筆輕輕挑取30頭5齡幼蟲于50 mL無蓋塑料離心管內(nèi)，加入40 g當(dāng)歸作為食料，用160目紗網(wǎng)做成的離心管蓋用皮筋綁在螺口處，放于1 000 mL廣口瓶中，將剪好的大小一致的濾紙放置廣口瓶底部，用移液器點(diǎn)滴一定量的甲酸乙酯在濾紙上，并用凡士林涂抹在瓶口處密封蓋緊瓶蓋。將廣口瓶置于人工氣候箱培養(yǎng)觀察，并統(tǒng)計(jì)甲酸乙酯熏蒸處理后煙草甲的存活與死亡數(shù)，根據(jù)前期預(yù)結(jié)果(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)采用2個(gè)亞致死濃度LC10(5 μL/L)和LC30(10 μL/L)，以及致死中濃度LC50(20 μL/L)的甲酸乙酯進(jìn)行熏蒸處理，參考姚潔等(2016)24 h后散氣挑取存活的試蟲，以相同條件下的空氣處理作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。按照1.3節(jié)方法分別提取上述處理樣品的RNA并合成cDNA，按照1.6節(jié)方法進(jìn)行qPCR，檢測LsGSTe1基因的表達(dá)。

1.8 煙草甲LsGSTe1基因的沉默及效率檢測

煙草甲LsGSTe1基因dsRNA (dsLsGSTe1)的體外合成按照使用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit說明書進(jìn)行，引物序列見表1，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)合成的dsRNA進(jìn)行檢測。煙草甲主要以幼蟲在寄主內(nèi)取食危害，是害蟲防治的關(guān)鍵時(shí)期，且前期qPCR結(jié)果表明LsGSTe1基因在煙草甲幼蟲中高表達(dá)，所以選取大小均一、生長狀況良好的煙草甲5齡幼蟲進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用顯微注射儀(World Precision Instruments公司)沿著血液流動(dòng)方向(頭部向腹部方向)，將200 ng dsLsGSTe1注射到5齡幼蟲的倒數(shù)第2和第3腹節(jié)之間，注射等量的dsGFP作為對(duì)照組。每個(gè)處理30頭試蟲，分別在48和72 h收蟲并凍存于-80℃，按照1.3節(jié)方法分別提取上述處理樣品的RNA并合成cDNA，按照1.6節(jié)方法進(jìn)行qPCR，檢測不同時(shí)間點(diǎn)RNAi的沉默效率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 RNAi干擾LsGSTe1后煙草甲對(duì)甲酸乙酯的敏感性分析

對(duì)分別注射200 ng dsLsGSTe1和dsGFP(方法同1.8節(jié))72 h后的5齡幼蟲進(jìn)行甲酸乙酯LC30(10 μL/L)和LC50(20 μL/L)兩個(gè)濃度毒力生物測定(同1.7節(jié))，每個(gè)處理40頭試蟲，24 h后統(tǒng)計(jì)死亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0軟件。采用2-△△CT計(jì)算煙草甲LsGSTe1基因的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)，將表達(dá)量最低的樣品數(shù)值視為1，其他樣品的表達(dá)量以相對(duì)于最低表達(dá)量的倍數(shù)進(jìn)行分析。煙草甲不同發(fā)育階段、不同組織及甲酸乙酯處理后mRNA表達(dá)差異采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。dsRNA注射后靶標(biāo)基因mRNA表達(dá)和試蟲敏感性測定采用T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LsGSTe1基因的克隆與序列分析

利用RT-PCR擴(kuò)增獲得煙草甲一個(gè)GST基因的cDNA全長序列，同源性比較確定該基因?qū)儆贕STs基因Epsilon家族，命名為LsGSTe1(GenBank登錄號(hào): MN480468)。LsGSTe1開放閱讀框長684 bp，編碼227個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.15，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為26.7 kD，且不存在N-糖基化位點(diǎn)。Prosite分析表明，LsGSTe1編碼的氨基酸具有2個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)合域的2個(gè)催化活性保守位點(diǎn)，第1-84位氨基酸為N末端結(jié)構(gòu)域，第90-215位為C末端結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 LsGSTe1基因的序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

LsGSTe1氨基酸序列BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：LsGSTe1與其他鞘翅目昆蟲Epsilon家族GSTs的同源性較高，其中與黃粉蟲Tenebriomolitor(GenBank登錄號(hào)： AIL23539.1)、赤擬谷盜Triboliumcastaneum(GenBank登錄號(hào)： XP_008190708.1)和白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis(GenBank登錄號(hào)： XP_018333399.1)GST氨基酸序列一致性分別為59%, 52%和48%。

將LsGSTe1與目前已經(jīng)鑒定的其他昆蟲(赤擬谷盜、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和家蠶)GSTs氨基酸序列進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示4種昆蟲的18個(gè)GSTs被分為6組(Delta, Sigma, Epsilon, Omega, Theta和Zeta)，其中LsGSTe1與同屬于鞘翅目的赤擬谷盜的TcGSTe15的氨基酸序列一致性高達(dá)74%，這表明LsGSTe1隸屬于Epsilon家族(圖2)。

2.3 LsGSTe1基因的時(shí)空表達(dá)

LsGSTe1在煙草甲檢測的所有發(fā)育階段均有表達(dá)，其在高齡幼蟲時(shí)期的表達(dá)量最高，顯著高于其他發(fā)育階段(P<0.05)，是低齡成蟲時(shí)期表達(dá)量的5.6倍，在低齡幼蟲和蛹期表達(dá)量略低，而在低齡和高齡成蟲期的表達(dá)量達(dá)到最低水平，顯著低于其他發(fā)育階段(P<0.05)(圖3: A)。煙草甲LsGSTe1表達(dá)部位主要在幼蟲脂肪體(P<0.05)，其次為中腸和表皮，而在馬氏管中的表達(dá)量最低(圖3: B)。

圖1 煙草甲LsGSTe1基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于煙草甲LsGSTe1和其他昆蟲GSTs氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000重復(fù))

圖3 煙草甲LsGSTe1在不同發(fā)育階段(A)和幼蟲組織(B)中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 甲酸乙酯處理后煙草甲LsGSTe1基因的表達(dá)模式

煙草甲5齡幼蟲受甲酸乙酯熏蒸脅迫后，LC30(10 μL/L)和LC50(20 μL/L)濃度組LsGSTe1基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，分別是對(duì)照組的2.96和5.80倍；而LC10(5 μL/L)濃度組與對(duì)照組的表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

2.5 RNAi對(duì)LsGSTe1的沉默效率

采用RNAi技術(shù)沉默煙草甲LsGSTe1 48 h和72 h后，結(jié)合qPCR檢測該基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，注射48 h和72 h后LsGSTe1表達(dá)量分別下降了79.9%和83.0%，極顯著低于對(duì)照(P<0.01)，說明通過RNAi已經(jīng)成功抑制該基因的表達(dá)(圖5)。

圖4 甲酸乙酯脅迫后煙草甲5齡幼蟲LsGSTe1基因的相對(duì)表達(dá)水平

圖5 RNAi對(duì)煙草甲5齡幼蟲LsGSTe1基因沉默效率

2.6 LsGSTe1沉默后煙草甲5齡幼蟲對(duì)甲酸乙酯的敏感性

通過生物測定實(shí)驗(yàn)結(jié)合RNAi技術(shù)，檢測煙草甲對(duì)熏蒸劑甲酸乙酯的敏感性，研究煙草甲LsGSTe1對(duì)甲酸乙酯的解毒代謝作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸乙酯LC30(10 μL/L)熏蒸處理下dsLsGSTe1處理組的死亡率達(dá)到45.5%，略高于對(duì)照組(dsGFP注射組)的死亡率(33.3%)，差異不顯著(P>0.05)；甲酸乙酯LC50(20 μL/L)熏蒸處理下dsLsGSTe1處理組的死亡率(80.0%)顯著高于LC50熏蒸處理下對(duì)照組(dsGFP注射組)的死亡率(47.6%)(P<0.05)(圖6)。

圖6 LsGSTe1基因沉默后煙草甲5齡幼蟲對(duì)甲酸乙酯的敏感性

3 討論與結(jié)論

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)一種重要的多功能催化酶，廣泛參與到昆蟲對(duì)外源殺蟲劑的解毒代謝過程，可被多種殺蟲劑誘導(dǎo)表達(dá)(Hemingwayetal., 2004)，與殺蟲劑耐受性相關(guān)的GSTs大多屬于Epsilon和Delta家族(Samraetal., 2012)。在埃及伊蚊中發(fā)現(xiàn)，DDT和溴氰菊酯可誘導(dǎo)GSTe2和GSTe7基因的過表達(dá)，在一定程度上表明GSTe2和GSTe7參與了DDT和溴氰菊酯的代謝解毒過程(Lumjuanetal., 2005)；同樣岡比亞按蚊體內(nèi)多個(gè)Epsilon家族GSTs基因在DDT抗性品系中過量表達(dá)(Ortellietal., 2003)；黑腹果蠅體內(nèi)DmGSTe6和DmGSTe7基因能夠?qū)谆鶎?duì)硫磷進(jìn)行代謝(Alias and Clark, 2010)。此外，馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata, 赤擬谷盜和中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae分別有30, 36和28個(gè)GSTs基因被鑒定，其中Epsilon基因分別有10, 19和12個(gè)基因?qū)儆贓psilon家族，但都缺乏進(jìn)一步功能分析(Shietal., 2012; Keelingetal., 2013; Hanetal., 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草甲經(jīng)甲酸乙酯LC30(10 μL/L)和LC50(20 μL/L)熏蒸處理后，體內(nèi)LsGSTe1基因表達(dá)水平分別上調(diào)2.96和5.80倍，誘導(dǎo)的LsGSTe1高表達(dá)可能參與到甲酸乙酯的代謝過程。

基因的時(shí)空表達(dá)特性可在一定程度上反映基因的功能(Yangetal., 2016a)。不同昆蟲體內(nèi)的GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量變化差異較大。如小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaGSTs1基因在卵和幼蟲階段高表達(dá)，而在蛹和成蟲階段則不表達(dá)(Youetal., 2015)；相反的是，二化螟ChilosuppressalisSigma家族的GST基因在成蟲期高表達(dá)，在蛹和幼蟲階段表達(dá)量相對(duì)較低(Liuetal., 2015)。在菜粉蝶Pierisrapae的研究中，發(fā)現(xiàn)PrGSTe2,PrGSTo4,PrGSTs4和PrGSTt1主要在4齡幼蟲期表達(dá)，而PrGSTe1在4齡幼蟲和蛹期高表達(dá)(Liuetal., 2017)。本研究中LsGSTe1表達(dá)模式與PrGSTe1類似，暗示LsGSTe1可能更大程度地參與到成蟲前期對(duì)寄主內(nèi)部外源化合物的解毒代謝過程中。為進(jìn)一步挖掘LsGSTe1的組織表達(dá)特性，本研究采用qPCR技術(shù)對(duì)LsGSTe1在煙草甲幼蟲不同組織部位的表達(dá)模式進(jìn)行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LsGSTe1在表皮、中腸、脂肪體和馬氏管4個(gè)組織中均表達(dá)，且在脂肪體中表達(dá)量最高，相同的結(jié)果還出現(xiàn)在對(duì)小菜蛾、家蠶和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的研究中(Yuetal., 2008; Liuetal., 2015; Youetal., 2015)。由于脂肪體是昆蟲的主要儲(chǔ)存能量器官，并在應(yīng)對(duì)外源有毒物質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Houetal., 2010)，因此我們推測LsGSTe1在脂肪體中的高表達(dá)可能與外源殺蟲劑的解毒代謝有關(guān)。

利用RNAi技術(shù)對(duì)昆蟲GST家族基因進(jìn)行功能分析，不僅可以為解析GSTs在殺蟲劑解毒中的作用提供直接證據(jù)，而且有助于揭示GSTs介導(dǎo)的殺蟲劑耐受性機(jī)制(Yuetal., 2016)。利用RNAi沉默朱砂葉螨TetranychuscinnabarinusTcGSTM7基因表達(dá)后，該螨對(duì)丁氟螨酯和甲氰菊酯的敏感性均顯著提高(申光茂等, 2018)。煙粉虱Bemisiatabaci體內(nèi)GST14被沉默后，其在噻蟲嗪脅迫下的死亡率顯著提升，表明GST14能夠明顯提高煙粉虱對(duì)噻蟲螓的耐受性(Yangetal., 2016b)，類似功能也出現(xiàn)在東亞飛蝗LmGSTs3基因的研究中(Qinetal., 2012)。最新研究發(fā)現(xiàn)，柑橘木虱DiaphorinacitriDcGSTe2和DcGSTd1兩個(gè)基因的共沉默，可導(dǎo)致柑橘木虱對(duì)甲氰菊酯和噻甲氧胺的抗性水平進(jìn)一步提升(Yu and Killiny, 2018)。本研究采用RNAi技術(shù)研究煙草甲LsGSTe1與甲酸乙酯代謝解毒的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)沉默LsGSTe1后，煙草甲對(duì)LC30(10 μL/L)的甲酸乙酯敏感性沒有發(fā)生顯著性變化，而對(duì)LC50(20 μL/L)的敏感性顯著上升(死亡率提高32.4%)，推測LsGSTe1基因可能參與煙草甲對(duì)甲酸乙酯的體內(nèi)解毒代謝。類似的結(jié)果出現(xiàn)在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera細(xì)胞色素P450氧化還原酶的研究中，發(fā)現(xiàn)目的基因沉默后，與對(duì)照組相比，棉鈴蟲對(duì)低濃度溴氰菊酯的敏感性無顯著差異，而高濃度處理組棉鈴蟲死亡率顯著增加(汪丹, 2011)。昆蟲在應(yīng)對(duì)低劑量/濃度的農(nóng)藥脅迫過程中，多種解毒代謝基因共同參與殺蟲劑的解毒代謝，具有一定的協(xié)同效應(yīng)(Liuetal., 2017)。因此，我們推測煙草甲在低濃度的甲酸乙酯的脅迫下，其他類解毒代謝酶基因可能在這一時(shí)期發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得煙草甲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因LsGSTe1的cDNA全長序列，該基因在煙草甲高齡幼蟲和脂肪體中表達(dá)較高，暗示其可能參與煙草甲對(duì)外源物質(zhì)的解毒代謝。進(jìn)一步研究抑制LsGSTe1基因的表達(dá)后，煙草甲對(duì)甲酸乙酯的敏感性與對(duì)照組相比明顯提高，表明LsGSTe1在煙草甲響應(yīng)甲酸乙酯脅迫并參與代謝過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。