王彥坤, 李天楚, 粘景梓, 陳思聰, 郝志霞, 姜金壯, 黃大衛(wèi),,*

(1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北保定 071002; 2. 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300071)

多重PCR是指在一次PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，從而同時產(chǎn)出多條目標(biāo)片段的技術(shù)，由Chamberlain等(1988)首次提出。目前多重PCR主要應(yīng)用于致病微生物的快速檢測：如針對靶標(biāo)致病微生物設(shè)計擴增產(chǎn)物大小不同的多對特異性引物，將這些引物同時用于對樣品進(jìn)行一次PCR擴增，然后將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，即可通過檢查擴增產(chǎn)物條帶的大小快速確定樣品中感染微生物的種類(Potrykusetal., 2014; Kimetal., 2015)。

自Hebert等(2003)引入DNA條形碼的概念以來，BOLD數(shù)據(jù)庫中基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (mitochondrial cytochromecoxidase subunit I, COI) 基因的條形碼超過350萬條，覆蓋超過21萬個物種(截至2019年10月) (Ratnasingham and Hebert, 2007)，成為動物物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)簽。在物種鑒定及進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究中，單一的DNA條形碼分析在一定程度上可以滿足實驗分析的需要，但在部分類群中，人們發(fā)現(xiàn)基于COI基因片段的DNA條形碼會受到線粒體假基因(Songetal., 2008)、線粒體異質(zhì)性(Magnacca and Brown, 2010)或是胞內(nèi)共生菌(Sunetal., 2011; Xiaoetal., 2012)的影響。因此在物種鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究中，為了獲得更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，人們通常會選擇多個分子標(biāo)記，例如在線粒體COI基因序列的基礎(chǔ)上，加測其他線粒體基因(沈媛等, 2010; Xiaoetal., 2012; Wangetal., 2017)。在常規(guī)實驗過程中，如果需要獲取單一樣本的多條標(biāo)記基因，需要對該樣品使用不同的引物進(jìn)行多次擴增。因此，當(dāng)需要快速準(zhǔn)確鑒定物種，或是樣本十分珍貴的情況下，上述實驗過程由于實驗流程顯著延長或樣本消耗加倍而存在諸多弊端。基于多重PCR的思路，在本研究中，我們考慮將雙重PCR的方式用于多分子標(biāo)記鑒定動物物種過程中的可能性，以期一次性獲得單一樣品的兩個標(biāo)記基因的序列，從而簡化獲取多個分子標(biāo)記的實驗過程，并減少樣本消耗。

1 材料與方法

1.1 動物樣本采集及基因組DNA提取

為了驗證實驗在不同類群中的實適用性，我們挑選了分屬于3綱8目14科的14種動物 (表1)，其中，家蠅Muscadomestica與大型溞Daphniamagna由河北大學(xué)免疫學(xué)實驗室飼養(yǎng)，黃粉蟲Tenebriomolitor于2014年購自河北省保定市花鳥魚蟲市場并飼養(yǎng)，甜菜夜蛾Spodopteraexigua于2018年6月購自河南濟源白云實業(yè)有限公司，小金蝙蝠蛾Hepialusxiaojinensis于2014年5月采自四川省黑水縣；其余標(biāo)本均于2018年6月采自河北省保定市河北大學(xué)校園內(nèi)，并依據(jù)形態(tài)將標(biāo)本初步鑒定至科。所有標(biāo)本采集后，浸泡于100%乙醇中，并在-20℃中保存。

基因組DNA提取時，首先對標(biāo)本的體表進(jìn)行清洗，隨后將整頭標(biāo)本(表1中標(biāo)本編號1， 11和13的3種動物)或部分附肢(其余11種動物，長度約5 mm)，按照EasyPureGenomic DNA Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書，提取基因組DNA，并將其溶解于200 μL Elution Buffer中，隨后將基因組DNA保存于-20℃。基因組DNA提取質(zhì)量通過擴增COI基因進(jìn)行檢驗。

1.2 雙重PCR及測序

常用于物種鑒定以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育的線粒體基因包括COI基因,Cytb(cytochromeb)和16S rDNA等。基于COI基因的DNA條形碼有數(shù)量非常龐大的數(shù)據(jù)庫，因此我們首先選擇LCO1490與HCO2198 (Folmeretal., 1994)為COI基因的引物。在其他線粒體基因中，16S rDNA也具有較廣泛的應(yīng)用(沈媛等, 2010; Wangetal., 2017)，因此我們選擇16S rDNA作為雙重PCR的備選基因?？紤]到基于COI基因的DNA條形碼長度為650 bp左右，我們挑選了16S rDNA基因中靶標(biāo)片段長度分別為392 bp和1 049 bp的兩個片段，并將其分別命名為16S-Small(16S-S)和16S-Large(16S-L)。與之對應(yīng)，我們設(shè)計了兩組雙重PCR體系，分別用于擴增COI+16S-S與COI+16S-L。實驗中所使用的引物見表2，由金唯智生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系: 10×TransTaq-T Buffer 5 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL, 引物 (10 μmol/L) 各1 μL,TransTaq-T Polymerase (5 U/μL) 1 μL, 模板2 μL (陰性對照為2 μL無菌水)，最后以ddH2O補充至50 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 35個循環(huán); 72℃再延伸7 min。最后將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色觀察后，按照EasyPureQuick Gel Extraction Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書回收對應(yīng)片段，并送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表2 本研究中使用的引物

16S-S和16S-L分別代表16S rDNA中長度為392 bp與1 049 bp的靶標(biāo)片段。下同。16S-Sand16S-Lrepresent the 392 and 1 049 bp fragments of 16S rDNA, respectively. The same below.*以黑腹果蠅線粒體基因組(GenBank登錄號: U37541)為參考序列；靶標(biāo)片段長度包括引物長度。The mitochondrial genome ofDrosophilamelanogaster(GenBank accession number: U37541) was used as the reference sequence; the target fragment length included the primer length.

1.3 生物信息學(xué)分析

1.2節(jié)PCR產(chǎn)物測序所得原始序列對齊后，進(jìn)行人工校對，并將兩端殘余的引物序列刪除，最后獲得了每個標(biāo)本的COI,16S-S以及16S-L3條序列，在GenBank中使用在線程序Blastn搜索每個物種3條序列的相似序列。根據(jù)Blast對比結(jié)果(identity等)以及初步的形態(tài)鑒定，將每頭標(biāo)本鑒定至種，或?qū)⑵湔J(rèn)定為尚未公布序列的物種。由于16S-S位于16S-L內(nèi)部，因此，我們僅將每個物種的COI與16S-L上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中。COI與16S-L的GenBank檢索號列于表1。

2 結(jié)果

2.1 通用引物雙重PCR檢測

在致病微生物快速檢測中，多重PCR的引物通常為特異性引物，以保證多重PCR擴增過程中沒有非特異擴增條帶的產(chǎn)生。在本研究中，為了檢測雙重PCR在較廣泛的動物類群中的普適性，基于動物類群中可通用的線粒體通用引物，我們挑選了兩組引物用于雙重PCR實驗，其中第1組雙重PCR實驗用于擴增COI與16S-S兩個分子標(biāo)記，而第2組雙重PCR實驗用于擴增COI與16S-L兩個分子標(biāo)記(預(yù)期擴增獲得的各分子標(biāo)記的靶標(biāo)序列區(qū)域及長度詳見方法1.2節(jié))。我們首先以果蠅為材料檢測了這兩組通用引物是否適用于雙重PCR。在以果蠅基因組DNA為模板檢驗雙重PCR效果的結(jié)果中，兩組雙重PCR體系均可以成功擴增靶標(biāo)片段，并且沒有非特異性條帶的產(chǎn)生(圖1)。

圖1 雙重PCR應(yīng)用于黑腹果蠅基因組DNA的擴增結(jié)果

2.2 多種動物類群的雙重PCR鑒定

在分屬于不同動物類群的14個物種的14頭標(biāo)本中，兩組雙重PCR實驗也可以成功地擴增靶標(biāo)片段，并沒有明顯的非特異性條帶的產(chǎn)生(圖2)。接下來，將14個物種的COI,16S-L以及16S-S序列預(yù)期長度對應(yīng)的電泳條帶分別進(jìn)行切膠回收并測序，進(jìn)而將測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行在線比對。COI,16S-L以及16S-S序列的在線比對和物種鑒定結(jié)果(表1)可以總結(jié)為以下4類：

(1)可通過線粒體COI基因和16S rDNA分子標(biāo)記有效鑒定至已知物種(序列一致性≥ 98%)。包括其9頭標(biāo)本(標(biāo)本1, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12和13)，其COI,16S-L以及16S-S序列可以分別鑒定至同一物種，并且具有較高的可信度，這些標(biāo)本的鑒定結(jié)果分別為：黑腹果蠅D.melanogaster，黃粉蟲T.molitor，光肩星天牛A.glabripennis，西方蜜蜂Apismellifera，日本弓背蟻Camponotusjaponicus，甜菜夜蛾S.exigua，小金蝙蝠蛾H.xiaojinensis，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽Corythuchaciliata以及大型溞D.magna。

圖2 14個節(jié)肢動物種的兩組雙重PCR擴增結(jié)果

(2)COI和(或)16S-L,16S-S序列與參考序列一致性略低于98%，但仍可鑒定至已知物種。包括2頭標(biāo)本：直翅目標(biāo)本8的COI,16S-L以及16S-S序列均可以比對至突灶螽的序列，并且與已知序列的一致性分別為96.70%, 99.69%和100%，因此標(biāo)本8的鑒定結(jié)果為突灶螽；半翅目標(biāo)本11的COI,16S-L以及16S-S序列分別比對至白楊毛蚜Chaitophoruspopuleti,C.populicola和C.saliapterus，序列一致性為分別為100%, 95.48%和96.59%，因此標(biāo)本11的鑒定結(jié)果為白楊毛蚜。

(3)通過COI和(或)16S rDNA不能有效鑒定至特定已知物種，可能為新種，或該物種的相關(guān)序列尚未公布。僅涉及1頭標(biāo)本，即蚰蜒目標(biāo)本14，其COI,16S-L以及16S-S序列均比對至Thereuonematurkestana，但與已知序列一致性分別為90.55%, 93.85%和93.81%，因此該標(biāo)本不能成功鑒定至種，在本文中標(biāo)記為Scutigeridae sp.。

(4)COI和(或)16S rDNA序列分別可以比對至兩個已知物種。包括另有2頭標(biāo)本：雙翅目標(biāo)本2的COI,16S-L以及16S-S序列均可以比對至家蠅M.domestica和毛足棒角蝗Dasyhippusbarbipes，并且一致性>98%；直翅目標(biāo)本7的COI序列可以比對至長翅素木蝗Shirakiacrisshirakii和中華蘿蘑肖葉甲Chrysochuschinensis，16S-L以及16S-S序列可以比對至長翅素木蝗S.shirakii。雖然標(biāo)本2與標(biāo)本7的基因比對結(jié)果中分別出現(xiàn)了兩個物種，但在實驗前，我們首先根據(jù)形態(tài)特征，將不同標(biāo)本劃分至科，因此我們確信標(biāo)本2和標(biāo)本7的鑒定結(jié)果分別為家蠅和長翅素木蝗。

3 討論與結(jié)論

目前多重PCR廣泛應(yīng)用于致病微生物檢測(郝少東等, 2015; Kimetal., 2015)中；此外也有研究者應(yīng)用多重PCR來擴增基因組(Quicketal., 2017; 孫嘉儀等, 2017)。在這些研究中，多重PCR所需引物均需要根據(jù)已知序列設(shè)計特異性引物。在本研究中，我們使用線粒體基因通用引物來檢測在不同動物類群中通過多重PCR技術(shù)同時獲取多條靶標(biāo)片段的可行性。我們首先考慮雙重PCR的可行性，通過雙重PCR產(chǎn)物的電泳圖，我們可以發(fā)現(xiàn)基于通用引物的雙重PCR技術(shù)可以可靠地擴增出目的條帶，并沒有非靶標(biāo)條帶的產(chǎn)生。本研究中，我們選取的靶標(biāo)片段為線粒體COI基因和16S rDNA，并且16S-L和16S-S兩個片段具有相似的物種鑒別能力。

引物的選擇與優(yōu)化被認(rèn)為是影響多重PCR效果最大的因素(Elnifroetal., 2000)。在本研究中，我們選取了線粒體基因COI與16S rDNA作為靶標(biāo)基因，因此我們不得不考慮本研究中挑選的兩對引物，在擴增過程中是否存在相互影響。首先，我們考慮了兩個基因的位置關(guān)系。由于大多數(shù)昆蟲線粒體基因組排列與昆蟲線粒體基因組原始排列順序一致(陳志騰和杜予州, 2016)，以黑腹果蠅線粒體基因組(U37541)為例，COI與16S-L兩個標(biāo)記基因片段之間的間距達(dá)到7 120 bp和10 641 bp；而本研究中所使用的DNA聚合酶TransTaq-T Polymerase的擴增速度為1～2 kb/min，PCR過程中延伸時間為40 s，這就意味著如果實驗物種沒有發(fā)生線粒體基因重排事件，兩個片段的引物是不會發(fā)生相互干擾的。其次，我們對比了引物之間的互補關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)相互之間有互補結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。本研究中，COI片段在兩組雙重PCR體系的擴增中均獲得了較明亮的條帶，而部分16S rDNA片段的條帶較暗，例如日本弓背蟻的16S-L片段，這可能與引物的熔解溫度或擴增產(chǎn)物片段大小相關(guān)；但50 μL的雙重PCR體系，使我們可以通過膠回收獲取足量的16S-L片段，滿足測序的要求。另外，針對多重PCR體系中部分產(chǎn)物較弱的問題，在多重PCR體系中增加對應(yīng)引物的量，增加引物與模板匹配的概率，也被認(rèn)為解決問題的有效方法(Elnifroetal., 2000; 郝少東等, 2015)。鑒于目前有大量針對線粒體基因組設(shè)計的通用引物，其中有的是針對動物界(Simonetal., 1994, 2006)，有的針對某一類群(張乃心等, 2013)，這些引物完全可以供我們在研究不同類群時，挑選不同的基因，嘗試不同的組合，開展用雙重或多重PCR策略進(jìn)行物種鑒定的工作。

本研究中，我們比較了雙重PCR法與常規(guī)方法在操作流程中的差異，兩種方法的最明顯差異體現(xiàn)在消耗的時間及樣本量中：采用傳統(tǒng)方法擴增兩種標(biāo)記基因所花費的時間以及消耗的DNA樣品，均是雙重PCR方法的兩倍；而如果后期我們可以用通過引物設(shè)計、體系優(yōu)化等方法實現(xiàn)多重PCR，即在一個反應(yīng)體系內(nèi)同時擴增3個或3個以上的標(biāo)記基因，這種差異會更加明顯。而在需要對樣品進(jìn)行快速物種鑒定，或是樣本材料十分珍貴的情況下，這兩點無疑是非常重要的。

準(zhǔn)確而豐富的DNA分子序列庫對基于DNA序列差異分析的物種鑒定工作十分重要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)家蠅與長翅素木蝗這兩頭標(biāo)本的線粒體DNA分別可以比對至兩個物種，甚至部分片段的序列一致性高達(dá)100%。而更令人吃驚的是，GenBank中已公布的唯一的毛足棒角蝗D.barbipes的線粒體基因組(GenBank登錄號: NC_041412)，與家蠅的線粒體基因組序列一致性高達(dá)99.56%～99.91%，而這些家蠅線粒體基因組測序是由不同作者完成的，因此，我們懷疑毛足棒角蝗D.barbipes已公布的線粒體基因組DNA可能受到了家蠅DNA的污染。另外，我們樣本中來自多足綱蚰蜒目蚰蜒科的標(biāo)本14，其COI序列和16S rDNA序列均未能以高可信度匹配至GenBank中的確切物種。這些結(jié)果提示我們，在進(jìn)一步完善DNA條形碼及其他標(biāo)記基因數(shù)據(jù)庫的同時，我們務(wù)必確保樣本沒有受到外源污染；此外，在對物種進(jìn)行分子鑒定之前，我們有必要基于形態(tài)學(xué)對樣本進(jìn)行初步劃分，以便應(yīng)對上述出現(xiàn)的問題。

基于通用引物的雙重PCR，可以在較廣泛的動物類群中，一次性擴增出單一樣本的多條標(biāo)記基因，可以節(jié)省大量時間與材料。對于需要快速準(zhǔn)確鑒定物種，或材料樣本十分珍貴的情況，雙重PCR是很好的選擇。