張建英， 湯 娟， 張 倩， 李先偉△

(皖南醫(yī)學院 1醫(yī)學影像學院， 2藥學院藥理教研室， 安徽 蕪湖 241002)

抑郁癥是一類精神障礙性疾病，其發(fā)病機制尚不明確[1]。大量研究表明海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)可塑性損害，特別是海馬神經(jīng)元樹突萎縮、缺失，可能是導致抑郁癥關(guān)鍵因素[2]。而抑郁癥介導的海馬神經(jīng)元可塑性損傷與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達變化有關(guān)[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者死后大腦海馬BDNF表達下調(diào)[4]。而向抑郁癥動物模型的海馬內(nèi)注入BDNF，能夠促進原肌球蛋白相關(guān)激酶B(tropomyosin-related kinase B, TrkB)磷酸化而產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)，這些研究表明抑郁癥的發(fā)生與BDNF/TrkB表達水平有關(guān)[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)表達異常導致的突觸傳遞障礙與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)，而氯胺酮通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)/mTOR信號通路，增加突觸傳遞功能從而產(chǎn)生快速抗抑郁作用[6-7]。Tao等[8]研究發(fā)現(xiàn)甘草素通過上調(diào)大鼠海馬BDNF/TrkB表達水平，進而激活PI3K/Akt/mTOR信號通路產(chǎn)生抗抑郁作用。以上結(jié)果提示BDNF/TrkB及其下靶點游PI3K/Akt/mTOR信號通路的表達異常與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定(dexmedetomidine, DEX)具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮、催眠和鎮(zhèn)痛等作用[9]。目前還發(fā)現(xiàn)DEX通過抗炎、上調(diào)BDNF和TrkB的表達而減輕腦缺血再灌注損傷導致的海馬神經(jīng)元損傷[10-11]。另外,Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)DEX通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路對缺血再灌注損傷的心肌產(chǎn)生保護作用。基于以上的研究背景，本實驗采用雙側(cè)卵巢摘除加慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激抑郁癥大鼠模型，以BDNF及其下游PI3K/Akt/mTOR信號通路為切入點，探討DEX對抑郁癥模型大鼠行為變化及空間學習和記憶能力的影響并探討其機制。

材 料 和 方 法

1 動物

雌性 Sprague-Dawley (SD)大鼠，體質(zhì)量 400～500 g。購于南京青龍山動物試驗中心,許可證號為SCXK(蘇)2016-0001。

2 藥物及主要試劑

DEX注射液(國藥準字H20090248，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);Nissl染色試劑盒(上海碧云天);抗白細胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(Santa Cruz)；抗蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、磷酸化PKA (p-PKA)、cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)、磷酸化CREB (p-CREB)、BDNF、TrkB、磷酸化TrkB (p-TrkB)、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)、mTOR和磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體(Abcam)；抗PI3K和磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體(CST)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR熒光定量試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；PCR引物設(shè)計合成(上海生工)。

3 方法

3.1抑郁癥大鼠模型的制備及實驗分組 根據(jù)文獻采用雙側(cè)卵巢摘除與慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激兩步法復制抑郁癥動物模型[13]。實驗分為：假手術(shù)(sham)組、模型(model)組及DEX(2.5、5和10 μg/kg)組，每組12只大鼠。DEX各劑量組腹腔注射給藥，連續(xù)給藥21 d。sham組和model組給予等體積生理鹽水。各種應(yīng)激方法參照文獻[14]，每日給予1種應(yīng)激刺激。

3.2強迫游泳實驗 末次應(yīng)激刺激后48 h內(nèi)進行強迫游泳實驗，具體方法詳見參考文獻[14]。讓大鼠強迫游泳6 min，記錄后4 min 內(nèi)大鼠強迫游泳不動時間(forced swimming immobility time, FSIT)。

3.3曠場實驗 末次應(yīng)激刺激后48 h內(nèi)進行曠場實驗，具體方法詳見參考文獻[15]。記錄6 min內(nèi)大鼠在曠場內(nèi)垂直運動(大鼠雙前足離地1 次為1 分)和水平運動(3 或4 只足同在一個格內(nèi)計1 分或穿越1 格計1 分)得分。

3.4Morris水迷宮實驗 給藥后第15 d開始對各組大鼠進行為期5 d的游泳訓練，第20 天進行正式實驗，具體方法詳見參考文獻[14]。數(shù)據(jù)采集和處理由Morris水迷宮視頻追蹤系統(tǒng)完成。

3.5海馬病理檢測 腹主動脈放血處死大鼠，多聚甲醛腹主動脈灌流固定10 min，開顱取腦，參照《大鼠腦讀片提要及圖譜》分離海馬組織。固定、包埋、切片后，按尼氏染色步驟進行染色，光鏡下觀察病理變化。

3.6RT-qPCR檢測大鼠海馬IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達 RT-qPCR操作方法及反應(yīng)條件參照我們前期的研究結(jié)果[16]。用StepOnePlus System SDS Software分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計各組2-ΔΔCt值，計算相應(yīng)RQ值，比較各組mRNA的表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

3.7Western blot檢測大鼠海馬相關(guān)蛋白的表達 低溫條件下提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。Western Blot具體操作方法詳見我們前期研究成果[16]。I抗分別為IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)、PKA(1∶1 000)、p-PKA(1∶500)、CREB(1∶1 000)、p-CREB(1∶1 000)、BDNF(1∶1 000)、TrkB(1∶1 000)、p-TrkB(1∶500)、PI3K(1∶1 000)、 p-PI3K(1∶500)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶500)及GAPDH(1∶2 000)，相應(yīng)II抗稀釋度為1∶2 000～1∶5 000。用ImageJ 1.43軟件進行灰度值測量并分析蛋白表達情況。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Newman-Keuls-Student多重比較q檢驗進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 DEX對抑郁癥大鼠FSIT的影響

大鼠FSIT由sham組的(81.2±9.1) s增加到model組的(121.9±11.8) s (P<0.01)，提示抑郁癥模型制備成功;與model組相比，DEX各劑量組大鼠FSIT明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見表2。

2 DEX對抑郁癥大鼠自發(fā)活動的影響

大鼠在曠場內(nèi)水平運動得分和垂直運動得分由sham組的87.1±6.8和38.6±4.5分別降低到mo-del組的40.4±3.7和18.8±2.2(P<0.01)，提示抑郁癥模型制備成功；與model組相比，DEX各劑量組大鼠水平運動與垂直運動呈劑量依賴性的增加(P<0.05或P<0.01)，表明DEX對大鼠抑郁樣癥狀具有一定的改善作用，見表2。

表2 右美托咪定對抑郁癥大鼠強迫游泳不動時間、水平運動及垂直運動的影響

Table 2. Effects of dexmedetomidine (DEX) on forced swimming immobility time, horizontal ambulation and vertical ambulation in depressive rats (Mean±SD.n=12)

GroupForced swimming immobility time (s)Horizontal ambulationVertical ambulationSham81.2±9.187.1±6.838.6±4.5Model121.9±11.8**40.4±3.7**18.8±2.2**DEX (2.5 μg/kg)110.2±12.350.2±4.8#24.5±2.9DEX (5 μg/kg)103.9±10.2#55.4±5.4##26.9±3.1#DEX (10 μg/kg)99.3±9.8##60.8±5.6##30.2±3.4##

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

3 DEX對抑郁癥大鼠空間學習與記憶能力的影響

大鼠逃避潛伏期由sham組的(7.6±1.4) s增加到model組的(15.9±3.7) s而穿越平臺次數(shù)由sham組的(4.8±1.3) min-1降低到model組的(1.7±0.8) min-1(P<0.01);與model組相比，DEX各劑量組大鼠逃避潛伏期明顯降低而穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05或P<0.01),表明DEX能夠改善抑郁癥大鼠空間學習與記憶能力，見表3。

表3 右美托咪定對抑郁癥大鼠空間學習與記憶能力的影響

Table 3. Effects of dexmedetomidine (DEX) on the spatial learning and memory ability in depressive rats (Mean±SD.n=12)

GroupEscape latency (s)Times of crossing the flat (min-1)Sham7.6±1.44.8±1.3Model15.9±3.7**1.7±0.8**DEX (2.5 μg/kg)12.0±3.52.9±1.0DEX (5 μg/kg)10.8±2.9#3.3±1.2#DEX (10 μg/kg)9.9±2.6##3.8±1.1##

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

4 DEX對抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元病理變化的影響

尼氏染色顯示sham組海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，而模型組海馬神經(jīng)元，排列紊亂，分層不清，胞膜皺縮，染色質(zhì)聚集、胞核不清楚;而給予不同劑量(2.5、5和10 μg/kg)DEX干預(yù)21 d后，上述病理損傷明顯減輕，表明DEX對抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元具有一定的保護作用，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of hippocampal neurons in each group (×400).

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學變化

5 DEX對抑郁癥大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達的影響

與sham組相比，model組大鼠海馬IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01);與model組相比，DEX(2.5、5、10 μg/kg)各劑量組IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，表明DEX具有一定的抗炎作用，見表4、圖2。

表4 右美托咪定對抑郁癥大鼠海馬IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達的影響

Table 4. Effects of dexmedetomidine (DEX) on IL-1β, IL-6 and TNF-α mRNA expression in hippocampal tissues of depressive rats (Mean±SD.n=8)

GroupIL-1βIL-6TNF-αSham1.01±0.101.03±0.111.02±0.09Model5.32±0.43**3.95±0.48**4.84±0.42**DEX (2.5 μg/kg)4.46±0.38#2.87±0.43#4.08±0.43#DEX (5 μg/kg)4.13±0.37##2.54±0.36##3.86±0.37##DEX (10 μg/kg)3.67±0.29##2.38±0.31##3.78±0.33##

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group. Dexmedetomidine: DEX.

6 DEX對抑郁癥大鼠海馬p-PKA、p-CREB、BDNF及p-TrkB蛋白表達的影響

與sham組相比，model組大鼠海馬p-PKA、p-CREB、p-TrkB及BDNF蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01);與model組相比，DEX各劑量組大鼠海馬PKA、CREB、TrkB蛋白磷酸化水平及BDNF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

7 DEX對抑郁癥大鼠海馬PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響

與sham組相比，model組大鼠海馬p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR蛋白水平均明顯降低(P<0.01);與model組相比，DEX各劑量組海馬PI3K、Akt及mTOR蛋白磷酸化水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

Figure 2. Effects of dexmedetomidine (DEX) on IL-1β, IL-6 and TNF-α protein expression in rat hippocampus detected by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖2 Western blot檢測各組大鼠海馬IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達情況

討 論

DEX是一種新型的高選擇性α2-腎上腺素受體激動劑，主要用于ICU鎮(zhèn)靜和輔助鎮(zhèn)痛[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)DEX通過促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，維持脊髓星形膠質(zhì)細胞活力而減輕脊髓缺血再灌注損傷導致的神經(jīng)元損傷[18]。動物實驗也發(fā)現(xiàn)DEX對大鼠顱腦創(chuàng)傷后的腦損傷具有腦保護作用，其機制與其抗炎、抗凋亡，減輕腦水腫有關(guān)[19]。而最近通過臨床和動物實驗發(fā)現(xiàn)DEX對預(yù)防術(shù)后認知功能障礙有積極作用[20]。以上結(jié)果表明DEX具有一定的神經(jīng)保護作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，與抑郁癥模型組相比，DEX各劑量組給藥21 d后，通過強迫游泳實驗發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠強迫游泳不動時間明顯降低，通過曠場實驗發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠自發(fā)活動明顯增加，通過Morris 水迷宮實驗空間學習與記憶能力明顯增強。這些研究結(jié)果表明右美托咪啶具有一定的抗抑郁作用。

Figure 3. Effects of dexmedetomidine (DEX) on p-PKA, p-CREB, BDNF and p-TrkB protein levels in rat hippocampus detected by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖3 Western blot檢測各組大鼠海馬p-PKA、p-CREB、BDNF 及p-TrkB蛋白表達情況

Figure 4. Effects of dexmedetomidine (DEX) on p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein levels in rat hippocampus detected by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖4 Western blot檢測各組大鼠海馬p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR蛋白表達情況

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的主要成員之一。研究發(fā)現(xiàn)BDNF及其受體TrkB參與了神經(jīng)突觸的可塑性調(diào)節(jié)，參與了情緒障礙相關(guān)疾病的病理生理學過程[21]。動物實驗發(fā)現(xiàn)氟西汀的抗抑郁作用除了抑制突出間隙的5-HT再攝取外，還與其增加CREB磷酸化水平、上調(diào)BDNF的表達有關(guān)[22]。另外Ge等[23]研究表明白藜蘆醇通過抗炎、上調(diào)CREB的磷酸化水平和BDNF的表達而抑制脂多糖誘導的小鼠抑郁樣行為。臨床研究進一步發(fā)現(xiàn)沃替西汀可能通過增加抑郁癥患者血漿BDNF水平，進而影響B(tài)DNF相關(guān)信號通路而發(fā)揮抗抑郁作用[24]。另外有研究證實DEX通過抑制NF-κB信號通路的激活、降低促炎因子TNF-α和IL-6的水平而減輕脂多糖誘導的急性大鼠肺損傷[25]。同時Zhu等[26]研究表明DEX能夠減輕大鼠術(shù)后認知障礙，其機制與其減輕海馬炎癥反應(yīng)、激活cAMP/PKA/CREB信號通路有關(guān)。綜上可知，DEX可能通過抗炎、激活cAMP/PKA/CREB信號通路、上調(diào)BDNF的表達和增加TrkB磷酸化水平而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEX處理21 d后，海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕，同時海馬炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平明顯降低，而PKA和CREB的磷酸化水平均顯著升高，同時BDNF的表達水平和TrKB磷酸化水平也顯著提高。這些結(jié)果表明右美托咪啶可能通過影響B(tài)DNF相關(guān)信號通路而發(fā)揮抗抑郁作用，但具體機制有待進一步研究。

mTOR是一種高度保守的絲/蘇氨酸激酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)由mTOR信號異常引起的海馬神經(jīng)元突觸蛋白缺陷與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[27]。而氯胺酮的抗抑郁效應(yīng)與其激活mTOR信號通路有關(guān)[7]。Koskimaki等[28]研究發(fā)現(xiàn)BDNF 是mTOR信號通路參與突觸可塑性和突觸傳遞的重要調(diào)節(jié)因子。另外Lima等[29]研究還發(fā)現(xiàn)丙戊酸通過激活BDNF/TrkB信號通路，活化PI3K/Akt，進一步激活mTOR信號通路，促進突觸可塑性和神經(jīng)生長而起到效抗抑郁作用。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量DEX均能上調(diào)海馬PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平，提示右美托咪啶可能通過調(diào)節(jié)海馬BDNF的蛋白表達、激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而產(chǎn)生抗抑郁作用。

綜上所述，DEX能夠改善抑郁癥大鼠行為及認知功能，其機制可能與其抗炎、上調(diào)海馬PKA和CREB磷酸化水平、提高BDNF的表達水平、促進TrKB磷酸化，進而活化PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)，但具體機制還有待進一步研究。