蔡 爽， 韓 冰， 鄭 璐， 湯 雷， 陳雨絲， 楊 毅， 趙金有， 楊 婷， 楊 勤， 謝汝佳

(貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，被認(rèn)為是世界上第5大常見(jiàn)腫瘤，也是腫瘤死亡的第3大原因?，F(xiàn)今，HCC治療正朝著特定靶點(diǎn)的靶向治療方向發(fā)展[1]。索拉菲尼(sorafenib, SOR)是一種多靶點(diǎn)口服抗腫瘤藥物,于2007年被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期HCC。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)是一種廣譜組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylases, HDACs)抑制劑，它以微摩爾濃度即可抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的活性并顯著提高核心組蛋白的乙?；剑瑥亩T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、分化或凋亡[2]，目前主要用于臨床血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一條凋亡信號(hào)通路，區(qū)別于死亡受體和線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡途徑，它通過(guò)自身信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，索拉菲尼與SAHA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[3-5]，但其具體的分子機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，在ERS誘導(dǎo)的多條凋亡信號(hào)通路中都充當(dāng)了下游凋亡信號(hào)分子的角色，因此，CHOP被認(rèn)為是ERS過(guò)程中一個(gè)重要的促凋亡蛋白。本研究主要探討CHOP在索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞MHCC97L凋亡中的作用，從而為索拉菲尼聯(lián)合SAHA治療肝癌提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

MHCC97L細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞送上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司用Axygen的基因組抽提試劑盒提取DNA，采用21-STR擴(kuò)增方案擴(kuò)增，在ABI 3730XL型遺傳分析儀上對(duì)STR位點(diǎn)和性別基因AMELX進(jìn)行檢測(cè)。本次檢測(cè)在該細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)多等位基因、未與數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的其它細(xì)胞相關(guān)STR信息發(fā)生匹配，未發(fā)現(xiàn)交叉污染，細(xì)胞系無(wú)異常。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

索拉菲尼由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科詹瑋博士惠贈(zèng)；SAHA(Abcam)；胎牛血清(ScienCell)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胰酶(Biological Industry)；彩虹 Marker(北京索萊寶科技有限公司)；DMSO(Sigma)；CCK-8(BBI Life Sciences)；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；兔抗GAPDH、兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、兔抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、兔抗活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)和兔抗CHOP(Abcam)；CHOP siRNA(上海吉瑪公司)；Lipofectamine 2000(Thermo)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞鑒定及培養(yǎng) 首先通過(guò)短串聯(lián)重復(fù)DNA分析對(duì)MHCC97L細(xì)胞進(jìn)行鑒定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MHCC97L細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換一次液；當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，以1 ∶2傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97L細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的索拉菲尼(0.5、1、3、6、12、25和50 μmol/L)、SAHA(0.5、1、3、6、12、25和50 μmol/L)及索拉菲尼聯(lián)合SAHA (劑量同前)處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8工作液 10 μL，37 ℃ 孵育2 h后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處測(cè)定各孔的吸光度(A)值，計(jì)算各組細(xì)胞活力并繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97L細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、索拉菲尼(12 μmol/L)組、SAHA(6 μmol/L)組以及索拉菲尼聯(lián)合SAHA組。給藥48 h后收集細(xì)胞，經(jīng)過(guò)75%乙醇4 ℃固定過(guò)夜，PBS洗滌后加入500 μL的PI/RNase A(9 ∶1)染色工作液，室溫避光30～60 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組同3.3，給藥48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min后，加入500 μL的binding buffer懸浮細(xì)胞，每組細(xì)胞中加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3.5Western blot法檢測(cè)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白水平的變化 收集對(duì)照組和藥物處理48 h后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入適量蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用 BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取40 μg總蛋白上樣，10 % SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉封閉90 min，用TBST洗膜3次后，加入相應(yīng)Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜3次后加入Ⅱ抗，室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。用Image Lab圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行定量分析。

3.6采用 CHOP siRNA沉默CHOP后，檢測(cè)索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97L細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中。隨機(jī)將細(xì)胞分為3組：SAHA+SOR組、control siRNA+SAHA+SOR組和CHOP siRNA+SAHA+SOR組。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30 %～50 %時(shí)，根據(jù) Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，棄去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，改用含索拉菲尼(12 μmol/L)聯(lián)合SAHA(6 μmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。經(jīng)AnnexinV-FITC/PI雙染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。所用CHOP siRNA序列見(jiàn)表1。

表1 人CHOP siRNA序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞活力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較，不同濃度的索拉菲尼和SAHA均能明顯抑制肝癌細(xì)胞MHCC97L的活力，且呈明顯的劑量依賴(lài)性。與單獨(dú)的索拉菲尼和SAHA組比較，索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)肝癌細(xì)胞活力的抑制作用更為顯著 (P<0.05)，見(jiàn)圖1。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇12 μmol/L索拉菲尼、6 μmol/L SAHA以及12 μmol/L索拉菲尼聯(lián)合6 μmol/L SAHA處理細(xì)胞。

Figure 1. The changes of the viability of MHCC97L cells treated with SOR or/and SAHA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vsSOR group;&P<0.05vsSAHA group.

圖1 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對(duì)MHCC97L細(xì)胞活力的影響

2 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較，12 μmol/L索拉菲尼、6 μmol/L SAHA 以及兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞周期分布均發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞周期均被阻滯在 G1期，S期與G2/M期的細(xì)胞減少，其中以聯(lián)合用藥組變化最為顯著，見(jiàn)圖2、表2。

Figure 2. The effects of SOR, SAHA and their combination on the cycle distribution of MHCC97L cells anayzed by flow cytometry.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對(duì)MHCC97L細(xì)胞周期分布的影響

表2 SOR、SAHA與聯(lián)合用藥對(duì)MHCC97L細(xì)胞周期分布的影響

Table 2. The effects of SOR, SAHA and their combination on the cell cycle distribution of MHCC97L cells (%. Mean±SD.n=3)

GroupG1SG2/MControl46.32±6.1232.86±5.2320.35±0.77 SOR70.49±2.82*24.89±0.344.91±2.80SAHA70.19±9.09*22.14±12.287.64±3.62SOR+SAHA74.01±2.63*20.53±4.671.25±0.20

*P<0.05vscontrol group.

3 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，12 μmol/L索拉菲尼、6 μmol/L SAHA 以及兩藥聯(lián)合均能明顯誘導(dǎo)MHCC97L細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)，凋亡率分別為(12.18±1.84)%、(13.18±1.08)%和(37.88±7.68)%，其中以聯(lián)合用藥組凋亡率最高，與索拉菲尼和SAHA單藥組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞中GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白水平的影響

與對(duì)照組比較，12 μmol/L索拉菲尼和6 μmol/L SAHA 可在一定程度上調(diào)GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白的水平，兩藥聯(lián)合上述效應(yīng)更加顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖4。索拉菲尼、SAHA及兩藥聯(lián)合對(duì)PERK蛋白的水平無(wú)明顯影響。

5 CHOP siRNA轉(zhuǎn)染MHCC97L細(xì)胞后對(duì)CHOP表達(dá)的影響

采用CHOP siRNA-1、CHOP siRNA-2及CHOP siRNA-3分別轉(zhuǎn)染MHCC97L細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示， CHOP siRNA-3組的CHOP表達(dá)下降最顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖5。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用CHOP siRNA-3進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

6 CHOP siRNA沉默CHOP基因后，索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，SOR+SAHA組、control siRNA+SOR+SAHA組和CHOP siRNA+SOR+SAHA組的凋亡率分別為(35.50±2.52)%、(36.10±6.15)%和(18.93±1.37)%，CHOP siRNA+SOR+SAHA組的凋亡率顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)合成、折疊、聚集和轉(zhuǎn)運(yùn)，也是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所。在一些病理性因素作用下，如缺血、缺氧、毒素刺激和氧化應(yīng)激等都可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[6]。ERS早期可通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)緩解應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。目前認(rèn)為ERS主要涉及3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白：肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、PERK和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。在正常情況下，這3種ERS受體蛋白均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶GRP78結(jié)合而處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中有大量未折疊蛋白或錯(cuò)誤蛋白堆積，GRP78與IRE1、PERK和ATF6解離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白或錯(cuò)誤蛋白結(jié)合，并幫助這些蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊[7]。此外，與GRP78解離后的PERK、IRE1和ATF6也可通過(guò)各自的途徑被激活，從而降低未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的聚集，例如PERK與GRP78解離后可通過(guò)自身二聚化和磷酸化被激活，被激活的PERK進(jìn)一步磷酸化其下游的真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)的Ser51位點(diǎn)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷。雖然ERS狀態(tài)下細(xì)胞能夠啟動(dòng)UPR來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的存活，但如果當(dāng)ERS持續(xù)或嚴(yán)重得不到緩解時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)法恢復(fù)自身穩(wěn)態(tài)，則會(huì)通過(guò)ERS誘導(dǎo)的凋亡通路而觸發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。因此，通過(guò)激活ERS凋亡通路促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，有望成為腫瘤治療的新方法、新靶點(diǎn)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼聯(lián)合SAHA能顯著抑制MHCC97L細(xì)胞的活力，且細(xì)胞生長(zhǎng)被阻滯在G1期；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明兩藥聯(lián)合能顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，說(shuō)明兩藥聯(lián)合在抑制肝癌細(xì)胞增殖的同時(shí)還促進(jìn)了肝癌細(xì)胞凋亡，成為其抗癌的重要機(jī)制，上述結(jié)果與Park等[4]的研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步深入闡明兩藥聯(lián)合促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)索拉菲尼組、SAHA組和聯(lián)合用藥組的GRP78、p-PERK和ATF4的蛋白水平均較對(duì)照組顯著上調(diào)，且索拉菲尼聯(lián)合SAHA能進(jìn)一步促進(jìn)上述蛋白水平的增加，說(shuō)明索拉菲尼、SAHA均可激活ERS信號(hào)通路，且兩藥聯(lián)合有一定的協(xié)同作用。

Figure 3. The effect of treatment with SOR or SAHA alone, or their combination for 48 h on the apoptosis of MHCC97L cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSOR group;&P<0.05vsSAHA group.

圖3 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對(duì)人肝癌MHCC97L細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The protein levels of GRP78, PERK, p-PERK, ATF4 and CHOP in the MHCC97L cells exposed to SAHA or SOR alone, or their combination for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSOR group;&P<0.05vsSAHA group.

圖4 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合處理MHCC97L細(xì)胞48 h后GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP的蛋白水平

Figure 5. The change of CHOP expression after transfection of CHOP siRNA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染CHOP siRNA后CHOP表達(dá)的變化

Figure 6. The effects of sorafenib combined with SAHA on the apoptosis of MHCC97L cells afterCHOPexpression was knocked-down. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSOR+SAHA group;#P<0.05vscontrol siRNA +SOR+SAHA.

圖6 CHOP沉默后，索拉菲尼聯(lián)合SAHA對(duì)MHCC97L細(xì)胞凋亡的影響

CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性的轉(zhuǎn)錄因子。在正常情況下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)CHOP的表達(dá)較低；當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，PERK介導(dǎo)其下游的eIF2α發(fā)生磷酸化，p-eIF2α進(jìn)一步激活下游的ATF4及CHOP的表達(dá)[9-11]。本研究顯示，經(jīng)索拉菲尼、SAHA及兩藥聯(lián)合處理細(xì)胞后，MHCC97L細(xì)胞中CHOP的蛋白水平顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)CHOP在調(diào)控ERS引起的細(xì)胞凋亡中扮演重要角色，它能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)[12-13]，而且還可以通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的合成和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]，故CHOP被認(rèn)為是ERS過(guò)程中一個(gè)由抗凋亡走向促凋亡的關(guān)鍵信號(hào)分子。最近Lei等[15]的研究表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，特異性敲除CHOP基因后，可顯著降低ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步明確CHOP在索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用，我們采用CHOP siRNA敲減MHCC97L細(xì)胞中CHOP的表達(dá)，觀察CHOP表達(dá)下調(diào)對(duì)索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHOP表達(dá)下調(diào)能顯著抑制索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，這說(shuō)明CHOP參與了索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程。

綜上所述，索拉菲尼聯(lián)合SAHA能夠通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞MHCC97L發(fā)生凋亡，且CHOP在此過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。