宋海巖， 周志新， 張玉祥

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 3首都醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100069)

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是一種侵襲性強，惡性程度高，死亡率高，預(yù)后較差的惡性腫瘤，一半以上的晚期患者5年生存率不足2%[1]。研究顯示PDAC最主要的特征是嚴重的腫瘤間質(zhì)增生性反應(yīng)(間質(zhì)纖維化)，而在這種結(jié)締組織增生反應(yīng)中，腫瘤相關(guān)的成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)，也稱為活化的胰腺星形細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)起著主導(dǎo)作用[2-3]。通過抑制PSCs的活化，使其恢復(fù)至靜息狀態(tài)，進而抑制其在PDAC中的作用，可能是PDAC治療中一條新的有效途徑。經(jīng)典的Notch信號通路中Notch1受體的NICD段與其下游轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合形成的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體參與肺纖維化中肌成纖維細胞的分化，調(diào)節(jié)細胞中α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)的表達[4]，我們前期的研究結(jié)果顯示Notch3依賴經(jīng)典的Notch信號通路參與調(diào)節(jié)PSCs的活化[5]，Notch1是否也參與PSCs的活化還未見報道。本研究利用人PDAC組織檢測Notch1的表達情況，利用原代培養(yǎng)的小鼠胰腺星形細胞檢測Notch1 siRNA對其活化程度及遷移能力的影響，從而探討Notch1在PSCs活化中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級野生型C57BL/6J小鼠購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重20～25 g，雌雄不限，光照時間為晝夜更替12 h∶12 h[許可證號為SCXK(京)2016-0011和SYXY(豫)2014-0005]，在室溫條件下自由飲食，直至實施實驗。

2 試劑

抗Notch1抗體和抗HES1抗體購自Santa Cruz；抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體購自Abcam；抗纖連蛋白(fibronectin)抗體和抗Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ, ColⅠ)抗體購自Proteintech；抗GAPDH抗體購自Sigma；Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-rabbit IgG、Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；DAPI購自Sigma；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot熒光 II 抗donkey anti-rabbit IgG購自LI-COR；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco；人胰腺癌組織購買于西安艾莉娜生物科技有限公司。

3 方法

3.1石蠟切片免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)脫蠟、水化后，3%過氧化氫(H2O2)室溫下封閉30 min以滅活內(nèi)源性的過氧化物酶活性，微波爐熱抗原修復(fù)，5%驢血清室溫封閉1 h，抗Notch1抗體(1∶100)孵育(陰性對照組加PBS)，4 ℃過夜，按照中杉金橋二步法免疫組化檢測試劑盒操作孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，脫水、透明，中性樹膠封片后室溫晾干，顯微鏡下觀察，采集圖像。

3.2石蠟切片免疫熒光染色 常規(guī)脫蠟、水化后(如前)，抗Notch1抗體(1∶100)和抗α-SMA抗體(1∶100)孵育(陰性對照組加PBS)，4 ℃過夜，抗兔熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 594或抗小鼠熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 488 1∶1 000稀釋，室溫避光孵育1.5 h，DAPI(1∶2 000稀釋)室溫避光孵育5 min，PBS洗3次，每次10 min。滴加抗熒光淬滅封片劑1滴，蓋玻片封片后，顯微鏡下觀察，采集圖像。

3.3小鼠PSCs原代培養(yǎng) 取出小鼠胰腺，移至超凈臺內(nèi)操作，用預(yù)冷的PBS洗2遍以洗去組織上所帶血液，剪去多余的脂肪組織后，將胰腺放在DMEM/F12培養(yǎng)液中。剪碎小鼠胰腺，多次剪切使其碎至直徑0.5～1 mm大小，用無菌吸管將其吸至培養(yǎng)皿中，加入少量的培養(yǎng)液充分鋪開胰腺組織塊，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h(利于組織貼壁)后加入足量的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔1 d換液。利用油紅O染色，對未活化與活化的PSCs進行鑒定。

3.4Notch1 siRNA及陰性對照(negative control, NC) siRNA轉(zhuǎn)染至PSCs 取生長狀態(tài)良好的活化PSCs，培養(yǎng)板中的細胞融合度達70%～80%?；旌蟬iRNA與LipofectamineTM2000，并將siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入6孔板中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使液體均勻覆蓋細胞(Notch1 siRNA的終濃度為50 nmol/L，陰性對照siRNA終濃度為50 nmol/L)，空白對照組只加1 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，各組均更換含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h和48 h后進行下一步的檢測。

3.5Western blot實驗 收集培養(yǎng)5 d未活化的PSCs與培養(yǎng)14 d活化的PSCs；收集轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA(48 h)，NC siRNA(48 h)及空白對照組的PSCs，利用RIPA裂解液提取總蛋白，12 000×g、4 ℃離心30 min，取上清，利用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Ⅰ抗[抗Notch1抗體(1∶500)，抗α-SMA抗體(1∶1 000)，抗fibronectin抗體(1∶500)，抗ColⅠ抗體(1∶500)，抗HES1抗體(1∶500),抗GAPDH抗體(1∶10 000)]4 ℃孵育過夜，熒光II抗(1∶1 000)室溫避光孵育2 h后，Odyssey曝光，ImageJ軟件分析灰度值。

3.6RT-qPCR實驗 收集培養(yǎng)5 d未活化的PSCs與培養(yǎng)14 d活化的PSCs，利用TRIzol試劑提取總RNA，利用NanoDrop? 2000檢測RNA濃度及純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書進行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR條件為:94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。

表1 RT-qPCR引物序列

3.7劃痕實驗 取生長狀態(tài)良好的活化PSCs，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2遍。用0.25% 的胰酶室溫消化3 min。加入2 mL含有20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。900 r/min 離心3 min后重懸細胞。按照約2×105個細胞的密度種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后用1 mL的無菌藍色吸頭在孔的中間劃痕，盡量保證每一個孔中劃痕的寬度一致。棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL無血清培養(yǎng)液以洗去懸浮的細胞。按照前面3.4所述的方法將Notch1 siRNA及NC siRNA轉(zhuǎn)染細胞。分別在轉(zhuǎn)染后24 h與48 h于鏡下觀察細胞愈合面積并采集圖像，利用ImageJ軟件測量愈合面積。

3.8CCK-8檢測PSCs的細胞活力 將生長狀態(tài)良好的活化PSCs接種于24孔板中，按照方法3.4步驟轉(zhuǎn)染細胞。分別取轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA及 NC siRNA 24 h，48 h和72 h的PSCs。棄去孔中的培養(yǎng)液，每孔新加入200 μL培養(yǎng)液。每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。設(shè)置酶標儀，在450 nm處測吸光度(A)值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。每次實驗結(jié)果均重復(fù)3次以上，實驗計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較的實驗設(shè)計采用t檢驗，多組間比較在方差齊性檢驗的基礎(chǔ)上行方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗進行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Notch1在PDAC組織中表達的檢測

對24例PDAC患者來源的腫瘤組織進行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示Notch1高度表達于PDAC中，陽性率達91.7%，Notch1不僅表達于腫瘤細胞中，同時也表達于間質(zhì)細胞中，見圖1A。為了檢測Notch1受體在胰腺癌間質(zhì)中的表達部位，利用免疫熒光雙標的方法進一步檢測了Notch1與PSCs活化標志物α-SMA的共表達情況，結(jié)果顯示，Notch1表達于α-SMA陽性的PSCs中，見圖1B。

2 小鼠原代PSCs的培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)5 d之內(nèi)的PSCs細胞形態(tài)呈現(xiàn)多種形態(tài)，三角形或星形，鏡下觀察細胞折光性較強，在胞質(zhì)中可見脂肪滴，見圖2A。油紅O染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)3 d的PSCs細胞胞漿中可見橙紅色顆粒；隨著培養(yǎng)時間的推移，PSCs的形態(tài)發(fā)生較大改變，細胞形態(tài)呈典型的星狀外形，偽足擴展明顯，胞漿中的脂滴逐漸消失，隨后細胞胞體變細長，并開始呈現(xiàn)成肌成纖維細胞樣形態(tài)，細胞胞漿中未見橙紅色顆粒，見圖2B。Western blot結(jié)果顯示，在蛋白水平，培養(yǎng)5 d的PSCs中α-SMA、fibronectin及ColⅠ蛋白的表達較低；而培養(yǎng)14 d的PSCs中α-SMA、fibronectin及ColⅠ的表達顯著升高(P<0.01)，見圖2C。同時，RT-qPCR結(jié)果顯示，在mRNA水平，培養(yǎng)5 d的PSCs中α-SMA、fibronectin及ColⅠ的mRNA表達較低；而培養(yǎng)14 d的PSCs中α-SMA、fibronectin及ColⅠ的mRNA表達顯著升高(P<0.01)，見圖2D。這些結(jié)果表明PSCs的原代培養(yǎng)成功，可進行下一步實驗。

Figure 1. The expression of Notch1 in the PDAC tissues. A: immunohistochemical staining was used to detected the Notch1 expression in PDAC tissues; B: immunofluoresence double staining was used to detected the Notch1 expression in PDAC tissues.

圖1 Notch1在PDAC間質(zhì)的表達

3 Notch1及HES1在小鼠原代PSCs中的表達

Western blot結(jié)果顯示，Notch1蛋白在未活化PSCs中表達較低，在活化的PSCs中的表達顯著升高(P<0.01)，Notch信號通路的下游靶蛋白HES1在未活化PSCs中較低，而在活化的PSCs中顯著升高(P<0.01),見圖3A；RT-qPCR結(jié)果顯示，與未活化PSCs相比，Notch1和HES1的mRNA在活化的PSCs中表達均顯著升高(P<0.01),見圖3B。

4 抑制Notch1表達對小鼠原代PSCs活化的影響

與陰性對照組相比較，轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA組中，活化的PSCs標志物α-SMA和ColⅠ蛋白的表達均顯著降低(P<0.05)，但是fibronectin及Notch信號通路的下游靶蛋白HES1的表達并無顯著變化,見圖4。這些結(jié)果提示，Notch1 siRNA干擾48 h在一定程度上可降低PSCs的活化程度，促使PSCs恢復(fù)未活化的狀態(tài)，并且Notch1參與PSCs的活化并不依賴經(jīng)典的Notch信號通路。

5 抑制Notch1對小鼠原代PSCs細胞活力與遷移的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，空白對照組與陰性對照組，細胞的愈合面積分別達到60.21% 和78.48%及46.12% 和73.22%，而在Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h和48 h組，細胞的愈合面積分別只有14.43% 和6.04%，與陰性對照組相比較，Notch1 siRNA組細胞愈合面積顯著降低(P<0.01)，見圖5。這說明Notch1 siRNA可抑制PSCs的劃痕愈合，抑制PSCs遷移。

CCK-8實驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后24 h，Notch1 siRNA組450 nm處A值與陰性對照組相比較無顯著變化(P>0.05)；在轉(zhuǎn)染后48 h，Notch1 siRNA組450 nm處A值與陰性對照組相比較顯著降低(P<0.05)；在轉(zhuǎn)染后72 h，Notch1 siRNA組450 nm處A值與陰性對照組相比較顯著降低(P<0.01)，見圖6。這說明Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染可使PSCs細胞活力受到抑制，且具有時間依賴性。

Figure 2. Culture and identification of primary PSCs in mice. A: the morphological changes of PSCs cultured for 24 h (×40); B: oil red O staining was used to idenify the PSCs (×40); C, D: Western blot and RT-qPCR were used to detect the expression of α-SMA, ColⅠ and fibronectin. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsunactivated PSCs.

圖2 小鼠原代PSCs的培養(yǎng)與鑒定

討 論

目前，聯(lián)合應(yīng)用細胞毒性藥物來殺死腫瘤細胞已取得較好的治療效果，然而PDAC患者的生存時間及生存質(zhì)量并沒有得到較大的改善[6]。PDAC最顯著的特征為腫瘤間質(zhì)的結(jié)締組織增生反應(yīng)，在腫瘤細胞周圍包繞著豐富的間質(zhì)，而活化的PSCs是引起胰腺炎與胰腺癌間質(zhì)結(jié)締組織增生的主要細胞[7-11]。PSCs在正常的胰腺組織中處于靜息狀態(tài)，分泌少量的ECM。在胰腺損傷，炎癥或腫瘤時，靜息狀態(tài)的PSCs可被細胞因子，生長因子或氧化應(yīng)激產(chǎn)物所激活，比如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)等，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谐杉±w維細胞樣特征的細胞[7]，細胞獲得增殖能力，可分泌大量的細胞因子和細胞外基質(zhì)，重構(gòu)胰腺間質(zhì)[3]，活化的PSCs表達α-SMA及ColⅠ等。

Notch基因是1917年Morgan及其同事在果蠅中發(fā)現(xiàn)的一個高度保守的基因家族，編碼4個跨膜受體，即Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch受體能夠被Notch配體家族所激活，通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用可激活Notch信號，在多種酶的作用下Notch蛋白的NICD段被剪切釋放入細胞質(zhì)，并進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES和HEY等轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用[12]。

Figure 3. The protein (A) and mRNA (B) expression of Notch1 and HES1 in unactivated and activated PSCs was detected by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsunactivated PSCs.

圖3 Notch1受體及HES1蛋白在未活化與活化PSCs中的表達

Figure 4. Western blot was used to determine the effects of Notch1 siRNA on expression of PSC activation markers such as α-SMA, fibronectin and ColⅠ, as well as Notch target protein HES1. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsNC siRNA group.

圖4 Western blot檢測Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染PSCs后各相關(guān)蛋白的表達變化

Figure 5. The effect of Notch1 siRNA on the migration ability of PSCs at 24 h and 48 h using scratch test (×20). Mean±SD.n=5.**P<0.01vsNC siRNA group.

圖5 利用劃痕實驗檢測在轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA 24 h與48 h后PSCs遷移情況

Figure 6. The effect of Notch1 siRNA on the viability of PSCs was measured by CCK-8 assay at 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsNC siRNA group.

圖6 利用CCK-8實驗檢測在轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA 24 h、48 h和72 h后PSCs細胞的活力

研究顯示，經(jīng)典的Notch信號通路中Notch1受體的NICD段與CSL結(jié)合形成的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體參與肺纖維化中肌成纖維細胞的分化，調(diào)節(jié)細胞中α-SMA的表達[4]。動物實驗顯示，Notch1/Jagged1-HES1信號通路參與心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[13]。在肝纖維化中，Notch-HES1參與肝星形細胞的活化[14]。我們前期的研究結(jié)果也顯示，Notch信號通路的受體Notch3高表達于PDAC組織中，且Notch3通過經(jīng)典的Notch/HES1通路調(diào)節(jié)PSCs的活化[5]，而Notch1受體是否參與PSCs的活化還未見報道。

本研究中，免疫組化結(jié)果顯示，Notch1在PDAC中表達的陽性率達91.7%，Notch1不僅表達于腫瘤細胞中，同時也表達于間質(zhì)細胞；免疫熒光雙標結(jié)果顯示，Notch1表達于α-SMA陽性的PSCs中，這就提示Notch信號通路可能參與PSCs的活化。

進一步我們對小鼠胰腺星形細胞進行分離培養(yǎng)，并利用油紅O染色，Western blot及RT-qPCR技術(shù)對未活化與活化的PSCs進行鑒定，結(jié)果顯示，我們成功培養(yǎng)了小鼠原代PSCs，為下一步的實驗做好了準備。

我們利用Western blot與RT-qPCR對Notch1及其下游靶基因HES1在未活化與活化的小鼠PSCs中的表達情況進行了檢測，結(jié)果顯示，Notch1及Notch信號通路的下游靶基因HES1在未活化PSCs中較低，而在活化的PSCs中顯著升高；我們進一步利用Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染PSCs 48 h后，Western blot結(jié)果顯示，活化PSCs的標志物α-SMA和ColⅠ蛋白的表達均顯著降低，但是，fibronectin及Notch信號通路的下游靶蛋白HES1的表達并無顯著變化。這些結(jié)果提示，Notch1 siRNA干擾48 h在一定程度上可降低PSCs的活化程度，促使PSCs恢復(fù)未活化的狀態(tài)，并且Notch1參與PSCs的活化而不依賴經(jīng)典的Notch信號通路。我們利用劃痕實驗及CCK-8實驗檢測了轉(zhuǎn)染Notch1后 PSCs的變化，結(jié)果顯示Notch1 siRNA可抑制PSCs的劃痕愈合能力，抑制PSCs的遷移能力及活力。

綜上所述，Notch1參與調(diào)節(jié)PSCs的活化，抑制Notch1的表達可抑制活化PSCs標志物α-SMA和ColⅠ的表達，降低PSCs的活化程度、遷移能力和細胞活力，并且Notch1調(diào)節(jié)PSCs的活化不依賴經(jīng)典的Notch信號通路。