★ 張華 嚴(yán)國(guó)鴻 賴昕 劉永靜 徐偉 褚克丹* 孫承韜

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院 福州 350000）

紅芽姜，又稱青州竹根姜，生長(zhǎng)分布于我國(guó)山東、福建、湖南，在福建省內(nèi)主要種植于閩北、三明、漳州等地。其植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，分枝數(shù)多。根莖皮淡黃色，芽淡紅色，根莖肉色蠟黃，纖維少。單株根莖重可達(dá)500g 左右，其中含有豐富的姜辣素，是傳統(tǒng)中藥炮制的優(yōu)質(zhì)原料藥材［1］，生姜汁入藥始見于漢代張仲景《金匱玉函經(jīng)》是生姜搗絞取汁［2］。其作為炮制輔料始見于南北朝《劉涓子鬼遺方》 ，其歷代文獻(xiàn)中姜制飲片多達(dá)90 多種，姜制方法有生姜浸、生姜自然汁拌蒸、姜汁浸焙、姜汁炙（炒）、姜汁煮、姜汁浸、姜汁煨、生姜汁淬等。沿用至今多為姜汁炒、姜汁煮［3］。姜辣素是姜酚、姜醇、姜酮等生姜中辣味成分的總稱，具有抑制血小板聚集、抗氧化、改善心血管和胃腸道功能、增強(qiáng)免疫力等作用，其中以6-姜酚含量最高［4］?！吨袊?guó)藥典》2015 年版將以6-姜酚（C17H26O4）、8-姜酚（C19H30O4）和10-姜酚（C21H34O4）為代表的姜辣素類化合物作為生姜含量測(cè)定項(xiàng)下的指標(biāo)性成分［5］，并規(guī)定6-姜酚的含量不得低于0.05%，8-姜酚和10-姜酚總量不得低于0.04%。

目前，對(duì)于福建閩產(chǎn)紅芽姜的品質(zhì)評(píng)價(jià)研究尚未系統(tǒng)展開，本研究采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定了福建省不同產(chǎn)地紅芽姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚這3 中姜辣素類化合物的含量，為建立以紅芽姜主要成分為基礎(chǔ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，為保證以紅芽姜為炮制輔料的紅芽姜制半夏藥材品質(zhì)，為閩產(chǎn)紅芽姜的進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Sctentific公司，型號(hào)：UltiMate3000 型）；電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司，型號(hào)：XS105Du）；超純水機(jī)（密理博中國(guó)有限公司，型號(hào)：Milli-Q Advantage）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE）。

1.2 試藥6- 姜酚標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：150623，四川維克奇生物科技有限公司）；8-姜酚（批號(hào)：111993-201601，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；10-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：111994-201501，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；紅芽姜（不同產(chǎn)地批次藥材由福建承天藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院褚克丹教授鑒定為姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的新鮮根莖）；乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)DIKMA 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10min，A：25%→40%；10～25min，A：40%；25～40min，A：40%→80%；40～45min，A：80%→25%），檢測(cè)波長(zhǎng)為282nm，進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃。在上述色譜條件下，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚3 種成分色譜峰峰間分離度良好（各相鄰色譜峰的分離度均大于1.5），理論板數(shù)按6-姜酚峰計(jì)算不低于5000，結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)照品（A）及樣品（B）液相色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.74、0.63、0.88mg/mL 的對(duì)照品溶液，分別精密移取上述3 種對(duì)照品溶液4.0、1.0、1.0mL 置于25mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得含有6-姜酚118.4μg/mL、8-姜酚25.2μg/mL 和10-姜酚35.2μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，均置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備取紅芽姜碎末5g，精密稱重，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量后超聲提取40min（300W，25kHz），冷卻后稱定重量，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察分別精密吸取“2.2 項(xiàng)下”混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20μL 進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣的樣品量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸得3 種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表1。由表1 可知，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚在相應(yīng)范圍內(nèi)，進(jìn)樣量（μg）與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 3種姜辣素類成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2” 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄3 種姜辣素類成分的峰面積，計(jì)算得6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚峰面積的RSD 值分別為1.03%、1.37%、1.74%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次紅芽姜，照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算紅芽姜中6-姜酚的含量平均值為1.16mg/g、8-姜酚的含量平均值為0.25mg/g、10-姜酚峰的含量平均值為0.38mg/g，RSD 值分別為1.88%、1.39%、1.72%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次紅芽姜，照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24、36、48h 進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚峰面積的RSD 值分別為1.50 %、1.69%、1.83%（n=8），表明處理后的供試品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)稱取已知6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚含量的紅芽姜樣品3g，共6 份，分別精密移取質(zhì)量濃度為0.74 mg/mL 的6-姜酚對(duì)照品溶液5mL，0.63mg/mL 的8- 姜酚對(duì)照品溶液1.2mL 和0.88mg/mL 的10- 姜酚對(duì)照品溶液1.2mL。照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的平均回收率分別為100.71%，98.46%和99.23%；RSD 值分別為1.65%，1.28%和0.82%（n=6）。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定分別稱取不同產(chǎn)地各6 批次的紅芽姜樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算紅芽姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地紅芽姜中姜辣素類成分含量均有一定差異，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地紅芽姜中3種姜辣素類化合物的平均含量（n=6）

3 討論

紅芽姜化學(xué)成分復(fù)雜，其中，姜辣素是生姜及其炮制品中的主要有效成分，其中含量最高的是姜酚類化合物，主要包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等10 余種成分，其中又以6-姜酚居多［6］。姜酚類化合物具有較高的生物活性和廣泛的藥理作用，可以作為評(píng)價(jià)紅芽姜藥物品質(zhì)的重要指標(biāo)，本研究前期采用單因素考察法，分別考察了提取溶劑（水、甲醇、乙醇、正丁醇），提取方法（加熱回流提取和超聲提?。┮约疤崛r(shí)間，利用HPLC 法進(jìn)樣分析，最終采用超聲提?。ǔ暪β屎皖l率為：300W，25kHz），提取時(shí)間為40min，提取溶劑為甲醇的提取工藝。

色譜條件方面，紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示：6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚在282 nm 附近具有最大吸收，因此本實(shí)驗(yàn)選擇282 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。同時(shí)，流動(dòng)相體系方面，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液和中國(guó)藥典2015 年版中生姜含量測(cè)定項(xiàng)下的乙腈-0.1%醋酸水溶液，最終結(jié)果表明，與使用乙腈-0.1%醋酸水溶液相比，乙腈-0.1%磷酸水溶液對(duì)三種姜酚類成分的分離度較高，且峰型較好、保留時(shí)間適宜，測(cè)定時(shí)間較藥典方法縮短了13min（藥典梯度洗脫時(shí)間為58min）。

本研究建立的HPLC 法所測(cè)得的3 種姜酚類化合物含量準(zhǔn)確，且重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，說明該方法成熟可靠，測(cè)得結(jié)果表明，紅芽姜中3 種姜酚類化合物含量均滿足《中國(guó)藥典》對(duì)生姜項(xiàng)下含量測(cè)定的要求，其中6-姜酚含量遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，保證了以紅芽姜為炮制輔料的紅芽姜制半夏的藥材品質(zhì)，有利于紅芽姜在中藥市場(chǎng)上的推廣。同時(shí)，也為紅芽姜的品質(zhì)評(píng)價(jià)研究提供了有效依據(jù)，為下一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過考察閩產(chǎn)紅芽姜中3 種姜辣素類化合物的含量，對(duì)福建省內(nèi)不同產(chǎn)地的紅芽姜進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)測(cè)定：福建建陽(yáng)所產(chǎn)紅芽姜中的6-姜酚和8-姜酚含量最高，其中8-姜酚含量為為福建南靖所產(chǎn)紅芽姜的1.19 倍。福建光澤所產(chǎn)紅芽姜中的10-姜酚含量最高，為福建南靖所產(chǎn)紅芽姜的1.13 倍。綜上，3 種姜辣素類化合物中，產(chǎn)地差異最明顯的為8-姜酚，對(duì)比同類型文獻(xiàn)［7］，其姜辣素類成分（6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚）含量較河南、山東等地所產(chǎn)生姜高。