鄭立威 李德瑤 魯鳳民 陳香梅

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥相關(guān)死亡原因的第二位，近年來發(fā)病率持續(xù)增長，嚴(yán)重威脅我國人民的生命健康[1]。肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，占原發(fā)性肝癌的85%～90%[1]。HCC的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療是改善患者生存預(yù)后的關(guān)鍵。我國85%以上的HCC與慢性HBV感染有關(guān)，因此在慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)患者中進(jìn)行HCC篩查和監(jiān)測是實(shí)現(xiàn)HCC早診斷的最有效途徑[1-2]。

目前臨床上用于HCC檢測和診斷的血液學(xué)指標(biāo)主要有血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)、異常凝血酶原(DCP)等，其中AFP為肝癌診斷和療效監(jiān)測中最常用且重要的標(biāo)志物[1-3]。研究表明，AFP在HBV感染相關(guān)HCC的診斷、預(yù)后評估方面都有一定價(jià)值[3-4]。但由于HCC隱匿性高，血清AFP診斷早期HCC的能力十分有限，經(jīng)此確診的大部分患者已處于疾病進(jìn)展期，并且在非HBV相關(guān)HCC患者中，AFP診斷HCC的靈敏度和特異度較低[4]。因此，當(dāng)前亟需開發(fā)能夠診斷早期HCC的無創(chuàng)性標(biāo)志物，以對HCC進(jìn)行更早的干預(yù)和治療。

一、關(guān)于5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)

近年來，血漿中細(xì)胞游離DNA(cfDNA)在腫瘤診斷中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。cfDNA中含有由腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死而釋放至外周血的DNA，因此cfDNA不僅含有與原發(fā)腫瘤細(xì)胞相同的體細(xì)胞突變類型，而且還具有相同的表觀遺傳模式[5]。其中，cfDNA的甲基化是目前研究最廣泛的一類表觀遺傳學(xué)特征，尤其是CpG島上的5-mC修飾。已有多項(xiàng)研究表明，cfDNA的甲基化檢測可作為包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤的診斷及預(yù)后指標(biāo)[6]。DNA去甲基化也是真核細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的一種重要模式。在DNA去甲基化過程的第一步，5-mC在TET蛋白的作用下被氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)[7]。5-hmC不僅是DNA主動(dòng)去甲基化過程的中間產(chǎn)物，也是一種穩(wěn)定存在的表觀遺傳標(biāo)記[8]。相較于5-mC修飾的沉默效應(yīng)，5-hmC修飾可以引起基因的激活表達(dá)，因此這一類表觀遺傳學(xué)修飾模式具有更高的疾病特異性，且能動(dòng)態(tài)、靈敏地反映疾病狀態(tài)下基因的表達(dá)水平。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，5-hmC在多種腫瘤中缺失，提示cfDNA的5-hmC檢測在腫瘤篩查、診斷及預(yù)后預(yù)測中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，也為HCC的診斷帶來了新的可能[9]。

二、5-hmC的檢測方法

目前已建立的5-hmC檢測方法包括UHPLC-MS/MS、hMe-Seal、5-hmC-Seal等[10-12]。其中5-hmC-Seal是在hMe-Seal技術(shù)基礎(chǔ)上優(yōu)化而成的全基因組5-hmC檢測方法，可以在1～10 ng cfDNA中對5-hmC進(jìn)行基因圖譜的繪制，是目前最先進(jìn)的5-hmC檢測技術(shù)[12]。

5-hmC-Seal技術(shù)利用β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶選擇性地將一個(gè)化學(xué)修飾過的葡糖基(6-N3-glucose)轉(zhuǎn)移到5-hmC的羥基上，然后向疊氮基團(tuán)標(biāo)記的5-hmC中加入生物素，通過磁珠對5-hmC修飾的DNA片段進(jìn)行富集，結(jié)合高通量測序技術(shù)分析5-hmC在基因組上的分布情況[12]。應(yīng)用5-hmC-Seal方法，已在結(jié)直腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤患者血漿cfDNA中檢測、分析5-hmC修飾水平，結(jié)果顯示血漿cfDNA的 5-hmC檢測可用于輔助癌癥診斷[13]。

三、5-hmC在HCC診斷中的應(yīng)用

近期，Cai等[11]通過一項(xiàng)包括1 204例HCC患者、392例CHB或LC患者及958例健康對照的隊(duì)列研究，建立了一個(gè)基于受試者血漿cfDNA 5-hmC修飾的HCC診斷模型。該研究將受試者分為訓(xùn)練集與驗(yàn)證集，通過對訓(xùn)練集結(jié)果的分析篩選出了917個(gè)在HCC與CHB/LC患者中 5-hmC水平存在差異的候選基因。進(jìn)而通過彈性網(wǎng)絡(luò)正則化方法及邏輯回歸模型從中篩選出了由32個(gè)在HCC患者cfDNA中5-hmC水平顯著升高的基因組成的5-hmC標(biāo)志物組合(5-hmC marker panel)，并最終建立了一個(gè)用于HCC診斷的加權(quán)評分(wd-score)診斷模型[11]。

盡管wd-score模型對晚期HCC的診斷效能與AFP相當(dāng)，但在區(qū)分早期HCC患者與健康對照、早期HCC患者與CHB/LC患者方面，該模型的診斷效能顯著優(yōu)于AFP。值得注意的是，聯(lián)合AFP與wd-score模型能夠進(jìn)一步提高診斷效能(AUC提高約1%)[11]。此外，早期HCC患者wd-score評分隨HCC分期進(jìn)展而升高。除分期外，wd-score還能預(yù)測腫瘤大小[11]，提示該模型或可作為HCC治療過程中療效的監(jiān)測指標(biāo)。將wd-score評分用于原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者發(fā)現(xiàn)，該模型可較好區(qū)分HCC及PDAC[11]，表明對HCC診斷具有特異性。

四、5-hmC與HCC相關(guān)性的潛在機(jī)制

多項(xiàng)研究表明，5-hmC修飾在外顯子、增強(qiáng)子區(qū)域富集[11, 13-15]，表明該修飾與基因表達(dá)激活相關(guān)。而腫瘤患者中5-hmC水平的異常[11, 13, 15]，則提示了5-hmC修飾在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用。因此，探索5-hmC在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用不僅有助于闡明5-hmc作為腫瘤標(biāo)志物的潛在機(jī)制，亦有利于腫瘤治療新靶點(diǎn)的開發(fā)。Cai等[11]對917個(gè)在HCC與CHB/LC中 5-hmC水平存在差異的候選基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些5-hmC水平異常的基因主要富集在各種代謝過程通路中，如“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”等，且其中相當(dāng)一部分基因與HBV感染、肝纖維化和HCC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[11]， 提示5-hmC可能參與了HBV感染相關(guān)的肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，HCC患者cfDNA中5-hmC修飾水平最高的幾種基因在HCC中表達(dá)上調(diào)[11]，提示5-hmC修飾與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，且這種表達(dá)調(diào)控功能可能通過H3K4me1和H3K27ac組蛋白修飾介導(dǎo)[11, 14]。

五、5-hmC作為HCC診斷的血清學(xué)標(biāo)志目前仍需解決的問題

作為一種新型腫瘤標(biāo)志物，已有多項(xiàng)研究報(bào)道了5-hmC在肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤組織及cfDNA中的異常表達(dá)狀態(tài)[11, 13-15]。與HCC、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤不同，肺癌患者cfDNA的5-hmC水平低于健康對照，且隨肺癌分期進(jìn)展逐漸下降[13]，提示5-hmC水平的變化在不同腫瘤中意義不同。在結(jié)直腸癌及胃癌中，可以分別通過檢測不同的特異性5-hmC修飾差異位點(diǎn)來區(qū)分患者與健康對照[15]，這說明5-hmC的診斷panel具有疾病特異性。盡管不同腫瘤背景下5-hmC富集的基因座的差異決定了Cai等[11]開發(fā)的wd-score診斷模型對HCC具有特異性，但此模型僅在HCC和小樣本的PDAC患者中進(jìn)行了臨床診斷效果驗(yàn)證，其HCC特異性尚需在胃癌、肺癌等其他常見腫瘤中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

LC患者是發(fā)生HCC的高危人群，其HCC年發(fā)生率約為1%～8%，且隨著年齡的增加，HCC的發(fā)病率也不斷增長。從成本效益分析來看，在肝硬化人群中進(jìn)行早期HCC的篩查監(jiān)測效果更佳[1-2]。Cai等在研究中未區(qū)分LC及CHB受試者，wd-score在單獨(dú)鑒別診斷LC與HCC患者時(shí)的診斷效能仍需在更大樣本量的臨床研究中得到證實(shí)。由于HCC患者基礎(chǔ)病史不同，在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性及非酒精性脂肪肝等不同慢性肝病發(fā)展形成的HCC患者中，5-hmC修飾水平是否存在差異也需進(jìn)一步結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析探究。

此外，值得注意的是，由于cfDNA組成成分復(fù)雜，僅有一部分cfDNA來源于腫瘤細(xì)胞，因此cfDNA中檢測到的突變(如KRAS、TP53突變)可能來自于cfDNA中的非腫瘤細(xì)胞部分，如造血細(xì)胞等[16]。而cfDNA表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤細(xì)胞基因組改變的關(guān)系目前還尚不清楚，但研究結(jié)果顯示cfDNA的5-hmC修飾水平的變化可能與腫瘤細(xì)胞并不一致[9-11, 15]，因此cfDNA診斷假陽性的問題仍值得關(guān)注。結(jié)合cfDNA上的腫瘤特異性突變(如EGFR、BRAF等)[16]或特定區(qū)域表觀遺傳修飾改變，將有助于這一問題的解決。

綜上所述，盡管大規(guī)模推廣5-hmC作為HCC的液體活檢仍存在諸多問題，5-hmC檢測因其操作無創(chuàng)性、組織特異性好、腫瘤特異性高，并且在HCC早期診斷時(shí)靈敏度和特異度均優(yōu)于血清AFP這一系列優(yōu)點(diǎn)，有望在不久的將來應(yīng)用于臨床肝癌診斷。但若想將cfDNA中的5-hmC修飾作為新型腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行推廣，目前的5-hmC檢測方法即5-hmC-Seal仍需要進(jìn)一步簡化和標(biāo)準(zhǔn)化，以增加檢測的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，并降低成本。