朱麗， 嚴晶， 聶煒玨， 孫志廣

（1.南京中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，江蘇南京 222100；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 222100）

結直腸癌（colorectal cancer）是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率在歐美國家居首位，且呈逐年增長趨勢。近年來，我國結直腸癌特別是直腸癌的發(fā)病率和病死率也呈不斷上升趨勢，結直腸癌的發(fā)病率在我國城市和農(nóng)村分別占惡性腫瘤發(fā)病率的第4位和第6位，嚴重威脅國民的身心健康[1]。為了降低結直腸癌的死亡率，尋求早期診斷結直腸癌的普查手段是十分必要的。

1 結直腸癌篩查方式概況

結直腸腺瘤是結直腸癌的主要癌前病變，尤其是進展期腺瘤。大約60%以上的結直腸癌都是由結直腸腺瘤演變而來，而由腺瘤發(fā)展至癌需要約6～8年的時間[2]。

目前結腸腺瘤及結直腸癌的篩查方法[1]有：（1）大便潛血試驗（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）。FOBT是目前應用最為廣泛的結直腸癌篩查方法，盡管FOBT簡便、安全、經(jīng)濟，并且在結直腸癌普查中取得了明顯的成功，但與病理檢測相比，F(xiàn)OBT易出現(xiàn)假陽性。（2）腸鏡、乙狀結腸鏡檢查。腸鏡、乙狀結腸鏡檢查是目前診斷結直腸癌的金標準，診斷結果最為可靠，但存在侵入性、費用高、檢測有痛苦、檢測操作要求高（除需相應設備場所外，檢查醫(yī)生尚需相應技術資質要求）、且有可能并發(fā)腸穿孔等不足。這些因素導致患者的依從性低且難以廣泛普及開展。（3）癌胚抗原（CEA、CA-199、CA-724）檢測。癌胚抗原如CEA、CA-199、CA-724等雖然可用于篩查腫瘤，但是對結腸癌沒有特異性，且經(jīng)此檢出的結直腸癌多屬中晚期，故僅作為診斷的輔助手段。（4）糞便DNA檢測。DNA檢測包括DNA突變、DNA完整性、癌癥相關甲基化分析等。糞便DNA檢測雖然無創(chuàng)，敏感性和特異度也較理想，但因操作復雜、費時、檢測成本太高而限制了推廣。（5）糞便免疫化學法檢測（fecal immunochemical test FIT）。FIT和FOBT類似，但FIT依賴于抗體檢測發(fā)現(xiàn)下消化道的腫瘤出血，比FOBT敏感性和特異性高。不足的是，F(xiàn)IT中使用的抗體的不穩(wěn)定性使它在轉運和儲存中容易分解并影響效果[3]。

隨著對結直腸癌的分子發(fā)生機制的深入理解，在腺瘤發(fā)展為腺癌的過程中，許多微小RNA（microRNA或miRNA）表達出現(xiàn)異常，且miRNA在糞便/血液中有極強的穩(wěn)定性和特異性，因此，miRNAs可作為結直腸腺瘤—腺癌臨床早期檢測及診斷結直腸癌的特異性新型生物標志物。目前已有大量研究表明多個miRNA在診斷結直腸癌中具有特異性及敏感性[4]，故考慮聯(lián)合多個miRNA基因檢測，以提高診斷結直腸癌的精準度。尋找結直腸腺瘤癌變發(fā)展序列過程中特異表達的非侵入性分子標記物miRNA，以及篩查出與結直腸腺瘤形成及癌變進展相關的miRNA，將對防治結直腸癌具有重要的理論意義和實踐價值。

2 miRNA標志物在結直腸癌診斷的應用

miRNA是一種含有21～23個堿基的內源性單鏈小分子RNA。目前已經(jīng)證實miRNA廣泛存在于各種真核生物細胞內，能完全或部分與其靶基因的mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域發(fā)生堿基的配對，完全匹配的結合可使靶基因mRNA降解，而不完全匹配的結合則使靶基因mRNA的翻譯受到抑制，從而誘導靶基因mRNA發(fā)生降解，最終抑制靶基因轉錄為蛋白質的進程。這些非編碼小分子RNA參與調控了大約人類基因組中30%的基因表達，可影響細胞增殖、分化、凋亡等過程。miRNA作為一類高度保守的小分子非編碼RNA參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、淋巴結轉移、遠處轉移及復發(fā)等多個過程，根據(jù)其調控的基因不同而發(fā)揮致癌因子作用或抑癌因子作用，其表達量的變化可作為疾病診斷或預后的標記物。

miRNA的異常表達對癌細胞的增殖分化具有促進作用，可表現(xiàn)為原癌miRNA的表達上調和抑癌miRNA的表達下調。原癌miRNA主要包括let-7b/g、miR-9、miR-17、miR-20、miR-21、miR-31、 miR-92a、 miR-96、 miR-135、 miR-141、miR-155、miR-205、miR-214、miR-224、miR-372、miR-708等。其中被研究最多的是miR-21，在許多癌病中miR-21都被認為是原癌miRNA。在結直腸癌中miR-21能通過靶向抑癌基因（如PDCD4、 TIAM1、 SPRTY、 PTEN、 TGFBR2、CDC25A等）促進腫瘤細胞的增殖和轉移[4]。而miR-92a則是通過抑制E-cadherin促進上皮間質轉化（EMT）[5]。抑癌miRNA主要包括let-7a、miR-7、miR-18a、miR-26b、miR-27b、miR-34a、miR-101、miR-125、 miR-138、miR-143、miR-144、miR-145、miR-194、miR-195、miR-320a、miR-365、miR-491等。研究較多的miR-143和miR-145通過下調胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）起到抑癌作用[6]。

2.1 血清miRNA與腺瘤及其癌變的相關性 通過檢測正常結直腸組織、結直腸管狀腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤及結直腸腺癌這一序貫發(fā)生的組織變化系列中miRNA的表達水平，可用于臨床分析正常結直腸組織、癌前病變、結直腸癌中的miRNA表達差異。

劉揆亮等[7]的研究表明，血清miR-204與miR-193b能成為診斷結直腸癌的生物標志物，miR-193b可能在腺瘤—腺癌序列中發(fā)揮抑癌作用。張婷[8]報道，結直腸腺瘤患者的miRNA-101在腺瘤組織中的表達高于腺瘤旁組織，在癌組織中的表達低于癌旁組織（P＜0.05）。朱林林等[9]證實在管狀腺瘤中miR-1、miR-9、miR-137、miR-145的表達均低于瘤旁正常組織，miR-31、miR-135a的表達均高于瘤旁正常組織，在管狀絨毛狀腺瘤中miR-1、miR-137、miR-145的表達均低于瘤旁正常組織，miR-9、miR-135a、miR-31的表達均高于瘤旁正常組織；在結直腸腺癌組織中miR-1、miR-9、miR-137、miR-145的表達均低于癌旁正常組織，而miR-31、miR-135a的表達高于癌旁正常組織。由此認為正常結直腸組織、結直腸腺瘤、結直腸癌中miRNA存在差異表達，提示上述miRNA在從正常結直腸組織到結直腸腺瘤、結直腸腺瘤到結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用[9]。

范慧娟[10]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-661、miR-591可能成為結直腸腺瘤和結直腸早期癌的非侵入性候選分子標志物，miR-215、miR-193b-3p、miR-302b-3p可能在結直腸腺瘤癌變中發(fā)揮作用。楊燕楠等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-499-5p的表達水平在正常結腸、結腸腺瘤、結腸癌姐織中呈逐漸増高的趨勢，說明其在結腸癌的癌變過程中呈動態(tài)變化。有研究者報道m(xù)iR-15a-3p能促進腺瘤發(fā)展至結腸癌[12]。劉華[13]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在結直腸癌和結直腸腺瘤病變組織及患者血清中表達顯著升高（P＜0.001），且miR-21在結直腸癌組中的表達明顯高于結直腸腺瘤組（P＜0.05）。

劉華等[14]對受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，簡稱ROC曲線）的分析結果顯示：對于鑒別結直腸癌與健康者，血清miR-21、miR-146a及二者聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.889、0.791和0.863；鑒別結直腸腺瘤與健康者，其AUC分別為0.784、0.692和0.761；鑒別結直腸癌與結直腸腺瘤者，其AUC分別為0.705、0.820和0.713；結果提示血清miR-21和miR-146a的差異表達在結直腸癌的早期診斷中具有潛在的價值。 Nu?ez-Sánchez M A 等[15]報道，結直腸小管腺瘤組織中的miR-1、miR-9、miR-137和miR-145表達減少，miR-31和miR-135a表達增加；結直腸小管絨毛腺瘤組織中的miR-1、miR-137、miR-145水平下降，miR-9、miR-135a和miR-31水平升高；結直腸癌組織中的miR-1、miR-9、miR-137和miR-145表達減少，miR-135a和miR-31表達增加。結果提示血清miR-20a和miR-486可作為結直腸腺瘤患者潛在的無創(chuàng)生物標志物。

2.2 糞便miRNA與結直腸腺瘤及其癌變的相關性 胡晶晶等[16]報道，早期的結直腸癌患者糞便中的miRNA-221表達上調，可能參與疾病的發(fā)生，提示糞便miRNA-221有可能成為診斷早期結直腸癌的無創(chuàng)標志物。鐘武等[17]的研究表明，Ⅲ＋Ⅳ期結直腸癌患者糞便中miRNA-21的表達水平要高于Ⅰ＋Ⅱ期結直腸癌患者（P＜0.05），低分化患者高于中高分化者（P＜0.05），有淋巴結轉移患者明顯高于無淋巴結轉移者（P＜0.05）；結果提示結直腸癌患者糞便miRNA-21表達的升高可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，糞便miRNA-21可能成為結直腸癌潛在的腫瘤標記物，為結直腸癌的早期篩查及診斷提供了新的思路。儲懷祝等[18]對糞便中miRNA-21表達用于結直腸癌診斷的文獻進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)靈敏度欠佳，但特異性較好，而多個miRNA聯(lián)合診斷結直腸癌能夠降低誤診率。王靜[19]的研究表明，聯(lián)合檢測人血漿及糞便中miR-92a-1表達水平在結直腸癌診斷及篩查中具有潛在的應用價值。韋皓棠[20]的研究表明，結直腸癌患者糞便中miRNA-21、miRNA-31、miRNA-92a、miRNA-143的表達與健康志愿者糞便中的表達具有明顯差異，可作為結直腸癌診斷的潛在腫瘤標志物，miRNA-21與miRNA-143的聯(lián)合檢測有望為結直腸癌篩查提供一種無創(chuàng)且敏感性與特異性較高的診斷方法。miRNA在糞便中的檢測效果較少受到糞便性質的影響，與糞便中是否有隱血，是否使用抗生素，飲食的種類等均無關，故糞便中的miRNA聯(lián)合檢測在結直腸癌的篩查中是有一定的前景的。

3 miRNA檢測結直腸癌對中醫(yī)藥研究的意義

《醫(yī)宗金鑒》描述結直腸癌的病因病機及病癥表現(xiàn)如下：“此證有內外、陰陽之別。發(fā)于外者，由醇酒厚味，勤勞辛苦，蘊注于肛門，兩旁腫突，形如桃李，大便秘結，小水短赤，甚者肛門重墜緊閉，下氣不通，刺痛如錐，脈數(shù)有力，多實多熱，屬陽易治，宜服一煎散，通利二便，菩提露搽之；腫痛仍前，不全退者，膿將成也，宜服托里透膿湯；膿脹痛針之；膿出之后，治同潰瘍門。發(fā)于內者，兼陰陽濕熱，下注肛門，內結臃腫，刺痛如錐，大便虛閉，小水淋漓，寒熱往來，遇夜尤甚，脈數(shù)微細，為虛為濕，屬陰難治，宜服五灰散，膿毒自然潰出；膿生遲者，服十全大補湯托之，潰后按潰瘍門”?？梢?，結直腸癌的中醫(yī)病機邪實與正虛同時存在的，邪實以痰濕、火熱、癖毒多見，正虛以正氣虧虛為主。

中醫(yī)的痰濕、火熱、癖毒與現(xiàn)代醫(yī)學中的炎癥介質類似。腸癌細胞會釋放大量炎癥介質，誘導腫瘤生長、轉移，而miRNA會隨著炎癥介質含量的變化而發(fā)生相應變化[21]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在不同組織、器官、細胞的生長發(fā)育過程中，其表達譜存在很大差異，即miRNA的表達具有時序特異性與組織特異性，而中醫(yī)的“證”也有即時性與差異性的特點，在這方面二者有相似的特性[22]。不同中醫(yī)證型患者血清miRNA的表達不同，若能建立血清miRNA的表達水平與證型的對應關系，則可彌補宏觀辨證的不足，將有助于辨證的客觀性和準確性，從而指導臨床處方用藥[23]。因此，通過檢測結直腸癌患者血清中miRNA表達數(shù)值的變化，從而得出結直腸癌不同證型患者血清miRNA表達譜，將為臨床上應用中藥治療不同證型結直腸癌患者療效的評估提供可靠的依據(jù)。

綜合以上分析可知，結直腸腺瘤或結直腸癌患者的血清及糞便中均可檢測出相關miRNA，以患者血清或糞便miRNA表達水平并結合其他實驗室指標的變化數(shù)值作為結直腸癌療效預測的生物標記物，在臨床過程中將患者分層，實施個體化治療，做到科學、合理、安全的用藥，可提高臨床療效。明確中醫(yī)不同證型患者血清miRNA表達譜的不同，并將miRNA表達水平作為中醫(yī)微觀辨證的生物標志物，可為實現(xiàn)中醫(yī)藥個體化治療奠定基礎。