陳 瑾，徐國(guó)興

0引言

干細(xì)胞(stem cell)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有經(jīng)培養(yǎng)不定期地分化并產(chǎn)生特化細(xì)胞的能力。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，當(dāng)成體干細(xì)胞被移植入受體中，它們表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性[1]。1999年有學(xué)者分離出小鼠的肌肉干細(xì)胞，體外培養(yǎng)5d后，與少量的骨髓間質(zhì)細(xì)胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細(xì)胞會(huì)分化為各種血細(xì)胞系[2]。這種現(xiàn)象被稱為干細(xì)胞的橫向分化(trans-differentiation)[3]。關(guān)于橫向分化的調(diào)控機(jī)制還不清楚。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為干細(xì)胞的分化與微環(huán)境密切相關(guān)。成體干細(xì)胞可以橫向分化為其他類型的細(xì)胞和組織，為干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。ES、成體干細(xì)胞能夠被定向誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[4-6]、感光細(xì)胞等，由此可獲得轉(zhuǎn)分化的大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞源，體內(nèi)干細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植有望應(yīng)用于各種視網(wǎng)膜退行性疾病的細(xì)胞替代治療。本文就各種干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的途徑及應(yīng)用進(jìn)行探討。

1視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生理與臨床

視網(wǎng)膜色素上皮是神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間含有黑色素的上皮細(xì)胞層，為單細(xì)胞層。其生理功能：吸收散射光線；控制視網(wǎng)膜下腔的液體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；視色素再生與合成；合成生長(zhǎng)因子和其他代謝物；維持視網(wǎng)膜的貼附；胞飲和消化光感受器的代謝廢物；維持電穩(wěn)態(tài)；創(chuàng)傷和手術(shù)后的再生和修復(fù)。臨床上許多視網(wǎng)膜疾病所發(fā)生的色素改變都發(fā)生在色素上皮層[7]。

視網(wǎng)膜變性等疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)以及青光眼等，將導(dǎo)致視覺(jué)功能的損傷，尤其是視細(xì)胞的丟失將導(dǎo)致視覺(jué)功能的永久喪失。目前各種治療方法尚無(wú)明確療效，收效甚微。近年來(lái)，基因和干細(xì)胞研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，學(xué)者們將研究重點(diǎn)放在了視網(wǎng)膜細(xì)胞的移植上，特別是視細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮，為上述疾病的治療提供了可能。基因治療技術(shù)在眼科取得了巨大的進(jìn)展,干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為科學(xué)家們開(kāi)辟了一條全新的道路。干細(xì)胞具有多向分化的潛能，故有望通過(guò)特定的體內(nèi)外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，為視網(wǎng)膜色素上皮退行性病變提供有效的細(xì)胞替代治療手段，將有功能的細(xì)胞代替損傷的細(xì)胞，從而恢復(fù)其功能。通過(guò)視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植,使其整合入視網(wǎng)膜各層并且分化為目標(biāo)細(xì)胞,以重建視網(wǎng)膜功能[8]。

2干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的途徑

2.1 ES誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞1998年,Thomson等[9]和Gearhart等[10]分別用ES和胚胎生殖細(xì)胞建立了人的ES系,在體細(xì)胞與生殖細(xì)胞間架起了橋梁,為研究ES的發(fā)育,在體外培養(yǎng)人體細(xì)胞和組織,利用ES治療疾病提供了廣闊的發(fā)展前景。

ES來(lái)源于囊胚期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有無(wú)限增殖、多向分化等特性，研究者們通過(guò)創(chuàng)造特定的體外培養(yǎng)條件，可將ES定向誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，已有大量研究成果證實(shí)這一方法的可行性，成功誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[11-15]，并有望成為視網(wǎng)膜退行性病變替代治療的細(xì)胞首選獲取途徑。

2.2成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞成體干細(xì)胞是存在于人與哺乳動(dòng)物已分化組織與器官中，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的尚未分化的不成熟細(xì)胞群體。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，可分化出組成該器官組織的各種細(xì)胞類型，替代生理性衰亡細(xì)胞在組織受損時(shí)起代償性增生作用，維持機(jī)體的正常結(jié)構(gòu)和功能。在體外可跨系、甚至跨胚系分化為某些成熟細(xì)胞。與ES相比，成體干細(xì)胞在應(yīng)用上有更大的優(yōu)勢(shì)[16]：(1)存在于人體各種組織和器官中，取材方便，不涉及倫理問(wèn)題。(2)正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，只有在病理情況下才顯示出一定的自我更新潛能，其導(dǎo)致細(xì)胞“永生化”甚至癌變的可能性較小。(3)可產(chǎn)生一個(gè)含有多種細(xì)胞成分的特定組織，移植入患者體內(nèi)后，有望產(chǎn)生該器官所有類型的目標(biāo)細(xì)胞，達(dá)到在結(jié)構(gòu)和功能上的修復(fù)或替代。(4)一些類型的成體干細(xì)胞可向體內(nèi)損傷甚至遠(yuǎn)離其發(fā)源地的部位遷移，成為前體細(xì)胞并分化為終末成熟細(xì)胞，用來(lái)修復(fù)組織損傷。也可將其作為目的基因的理想載體。(5)某些成體干細(xì)胞可分泌生長(zhǎng)因子，發(fā)揮動(dòng)員或保護(hù)該組織其他細(xì)胞的作用以加強(qiáng)移植效果。人們可以利用基因工程手段對(duì)成體干細(xì)胞進(jìn)行操作，以補(bǔ)充患者組織中缺乏的某些成分。

成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，即使在含量豐富的骨髓細(xì)胞，每10000～15000個(gè)骨髓細(xì)胞中只有一個(gè)造血干細(xì)胞[17]，人和動(dòng)物皮膚中的干細(xì)胞含量?jī)H為7%～8%[18]。目前發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的成體干細(xì)胞主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、脂肪干細(xì)胞等。

2.2.1 MSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞成人的MSCs主要來(lái)源于骨髓，具有多向分化潛能，可作為誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的種子細(xì)胞[19-20]。 MSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD34、CD14及白細(xì)胞表面抗原CD45，而表達(dá)SH2、SH3、CD29、CD106和CD166等表面抗原[21]。血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)作為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，對(duì)體外MSCs生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[22]。在合適的條件下，MSCs易誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)組織細(xì)胞如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。已有研究表明，大鼠MSCs可在體外成功誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[23]。

MSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可通過(guò)眼內(nèi)注入法和體外誘導(dǎo)法來(lái)實(shí)現(xiàn)。(1)眼內(nèi)直接注入法：有研究表明，將MSCs直接注入RCS大鼠視網(wǎng)膜下，MSCs能與視網(wǎng)膜色素上皮層及視網(wǎng)膜神經(jīng)層整合[24-28]，并能表達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮特征性標(biāo)志物，如細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)與S-100[29]。誘導(dǎo)分化而來(lái)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可挽救部分病變的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[30]。另有學(xué)者通過(guò)向患有視網(wǎng)膜色素變性RCS大鼠的鼠尾靜脈注射MSCs[31]，注入的細(xì)胞可遷移至視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，此法相對(duì)無(wú)創(chuàng)，可減少高眼壓、眼內(nèi)炎等風(fēng)險(xiǎn)，并能延緩視力喪失。通過(guò)眼內(nèi)直接注入法雖能使誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)標(biāo)記物，且能夠遷移至視網(wǎng)膜色素上皮層，但由于分化的細(xì)胞缺乏視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞典型形態(tài)及細(xì)胞功能，其療效尚待進(jìn)一步觀察。(2)體外誘導(dǎo)法：為使誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能夠獲得正常視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的典型形態(tài)及細(xì)胞功能，近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)進(jìn)行了大量的研究和探索，包括與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)[32-33]，或添加誘導(dǎo)劑[34-36]進(jìn)行誘導(dǎo)。2013年，Duan 等[32]利用Transwell膜隔離培養(yǎng)豬視網(wǎng)膜色素上皮和人MSCs，共培養(yǎng)14d后骨髓干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)色素顆粒，并表達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞標(biāo)記物，具有吞噬功能和一定的分泌功能。盡管體外誘導(dǎo)法取得了一定的成果，但誘導(dǎo)分化的細(xì)胞僅具備正常視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的部分功能，目前尚存在誘導(dǎo)率低，移植后存活率低等問(wèn)題。

2.2.2脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來(lái)源于不同部位的脂肪干細(xì)胞的數(shù)量和分化潛能不同，白色脂肪內(nèi)的含量多于棕色脂肪，而與腹部、大腿和乳房來(lái)源的脂肪組織相比，人的前臂組織中含有更多的脂肪干細(xì)胞。用不同的誘導(dǎo)方法可以跨胚層定向分化形成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞，肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。與來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞不同，脂肪干細(xì)胞的分化能力不會(huì)隨著提供者年齡的增加而降低。迄今為止，脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞方法主要還是采用體外誘導(dǎo)，包括與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞共培養(yǎng)或聯(lián)合光細(xì)胞感受器進(jìn)行誘導(dǎo)，或添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)[37-38]，誘導(dǎo)劑含有各種生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、視黃酸和牛黃酸 、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ, IGF-Ⅰ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (transforming growth factor, TGF)、PDGF等,這些生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液制備成脂肪干細(xì)胞的誘導(dǎo)液,聯(lián)合誘導(dǎo)劑的應(yīng)用,可以創(chuàng)造一個(gè)更好的細(xì)胞誘導(dǎo)微環(huán)境。研究證實(shí)了脂肪干細(xì)胞可以體外誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器細(xì)胞，但脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮不能做到充分的分化，誘導(dǎo)出來(lái)的細(xì)胞功能也與正常成熟的細(xì)胞存在差異。Rezanejad等[37]研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞僅能誘導(dǎo)分化出少量的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，且不具有正常細(xì)胞的形態(tài)功能。脂肪干細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜退行性疾病的細(xì)胞替代治療方面具有巨大潛力。

3小結(jié)與展望

ES是細(xì)胞的源頭,具有多向分化功能或全能性,并能夠定向分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,因此在視網(wǎng)膜退行性疾病的細(xì)胞替代治療方面前景廣闊。但它存在著取材不便、移植免疫排斥的限制和倫理學(xué)方面的困擾。而成體干細(xì)胞只能在體外有限誘導(dǎo)擴(kuò)增為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,通過(guò)體外的擴(kuò)增培養(yǎng)雖能夠提高轉(zhuǎn)化效率, 然而體外轉(zhuǎn)化是否會(huì)引起干細(xì)胞遺傳特性的改變尚不清楚，但這類干細(xì)胞存在于宿主體內(nèi),可直接從患者自身獲得,故無(wú)移植免疫排斥的限制也無(wú)倫理學(xué)方面的困擾。

干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的研究目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段，雖然取得了一定的成果，為一些視網(wǎng)膜退行性病變?nèi)缫暰W(wǎng)膜色素變性等疾病的替代治療帶來(lái)希望，但同時(shí)應(yīng)認(rèn)識(shí)到在干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中出現(xiàn)的一些問(wèn)題，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的機(jī)制尚未完全明確；多能干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化中可導(dǎo)致組織瘤變風(fēng)險(xiǎn)；移植后的免疫排斥問(wèn)題；可能導(dǎo)致早衰等。

細(xì)胞移植是治療視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變性疾病最具前景的方法，但是如何獲得經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，數(shù)量充足且低免疫排斥和低成瘤風(fēng)險(xiǎn)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是目前細(xì)胞治療視網(wǎng)膜色素上皮變性疾病的所面臨的主要問(wèn)題。隨著干細(xì)胞組織工程的研究進(jìn)一步發(fā)展，干細(xì)胞細(xì)胞移植將為視網(wǎng)膜色素上皮變性疾病等致盲性眼病的治療開(kāi)辟新的途徑。