王 悅，徐國(guó)興

0引言

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組遺傳性、致盲性視網(wǎng)膜疾病。RP的遺傳方式具有多樣性，主要有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳以及X連鎖遺傳，還有少部分為線粒體及雙基因遺傳[1]，臨床工作中也有發(fā)現(xiàn)較多的散發(fā)型病例。日本一項(xiàng)大規(guī)模的研究測(cè)序[2]表明EYS, USH2A, RP1L1, RHO, RP1和RPGR的突變是65.4% RP患者患病的原因。雖然RP具有遺傳異質(zhì)性，但視錐及視桿細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致功能的喪失為共同的最終結(jié)果。該病的主要臨床癥狀為夜盲、進(jìn)行性視野缺損，眼底檢查可見視盤蠟黃、視網(wǎng)膜血管變細(xì)、視網(wǎng)膜骨細(xì)胞樣色素沉著。 Sujirakul等[3]2a期間對(duì)71例RP患者進(jìn)行隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)超過(guò)75%的患者病情呈顯著的進(jìn)展，且靠近黃斑中心凹時(shí)進(jìn)展速度顯著減慢，支持RP以指數(shù)方式進(jìn)展的理論，另發(fā)現(xiàn)有19%的患者左眼與右眼的病情進(jìn)展有差異。

1 RP的分類

因RP的臨床表型和基因突變的相關(guān)性部分尚未明確，故其在診斷上及分類上還缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，分類方式多樣[4]。(1)按有無(wú)明確病因分類: 原發(fā)性RP 和繼發(fā)性RP；(2)按有無(wú)家族遺傳史分類: 家族遺傳型RP，包括常染色體顯性遺傳RP、常染色體隱性遺傳RP、X 染色體連鎖遺傳型RP、雙基因遺傳、線粒體遺傳單純型RP；(3)按有無(wú)合并全身其他癥狀分類：?jiǎn)渭冃蚏P和綜合征型RP，綜合征型RP除具有單純型RP表現(xiàn)外，還可伴隨聽力喪失、前庭功能障礙、軀干性肥胖、多趾畸形、認(rèn)知功能障礙等表現(xiàn)，以Usher綜合征和Bardet-Biedl綜合征(BBS)較為常見。

2新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)在RP中的應(yīng)用

RP主要是因基因突變引起，若想獲得良好的治療效果，必需要從病因入手。目前發(fā)現(xiàn)大于50個(gè)突變的基因與非綜合征型RP相關(guān)，12個(gè)突變的基因可導(dǎo)致Usher綜合征及17個(gè)突變的基因與Bardet-Biedl綜合征有關(guān)[5]?；驕y(cè)序技術(shù)的發(fā)展為RP的分子生物學(xué)研究提供了極大的幫助，近年來(lái)RP基因的發(fā)現(xiàn)主要依靠新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)[6]，雖然目前已經(jīng)發(fā)展至第四代技術(shù)，但第二代測(cè)序技術(shù)仍是使用最多的技術(shù)，其又稱為高通量測(cè)序技術(shù)，主要原理[7]：第一步為構(gòu)建 DNA 模板文庫(kù)，把DNA 固定在芯片表面或微球表面；第二步通過(guò)擴(kuò)增形成 DNA 簇或擴(kuò)增微球；最后利用聚合酶或者連接酶進(jìn)行一系列循環(huán)的反應(yīng)操作，通過(guò)CCD相機(jī)采集每個(gè)循環(huán)反應(yīng)中產(chǎn)生的光學(xué)事件信息，從而獲得 DNA片段的序列。應(yīng)用范圍主要包括以下3個(gè)方面：(1)基因組學(xué)；(2)轉(zhuǎn)錄組學(xué)；(3)表觀組學(xué)。第三代測(cè)序是在單細(xì)胞和單分子水平上進(jìn)行基因組測(cè)序的新技術(shù)[8]。較二代測(cè)序技術(shù)相比，三代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在：(1)測(cè)序通量高；(2)測(cè)序成本低；(3)讀取長(zhǎng)度長(zhǎng)；(4)測(cè)序時(shí)間短；(5)所需起始用量更少且精確性高[8]。第四代測(cè)序技術(shù)主要是納米孔測(cè)序，是利用不同堿基的電學(xué)性質(zhì)差異，通過(guò)納米孔等直接對(duì)堿基穿過(guò)電極時(shí)的電流變化進(jìn)行測(cè)序[9]。對(duì)于三種新一代測(cè)序技術(shù)，它們有各自的優(yōu)點(diǎn)以及缺點(diǎn)，要使測(cè)序技術(shù)更好地應(yīng)用于RP的分子診斷，關(guān)鍵在于合理評(píng)估以選擇合適的測(cè)序平臺(tái)。結(jié)合常規(guī)的Sanger測(cè)序和NGS的結(jié)果，使用粗略估計(jì)，可以檢測(cè)到20%～30%的隱性遺傳方式，60%～70%的常染色體顯性遺傳形式，80%～85%的X性連鎖遺傳形式[10]。因RP具有遺傳異質(zhì)的特點(diǎn)，部分基因型-臨床表型的一致性尚不明確，國(guó)外文獻(xiàn)有報(bào)道利用系統(tǒng)化的NGS數(shù)據(jù)分析、Sanger測(cè)序驗(yàn)證和分離分析來(lái)鑒定致病性突變，72例確診的致病性突變的患者中有58例攜帶已知LCA或少年RP基因的突變，并表現(xiàn)出相應(yīng)的表型，而另外14例與他們最初的臨床診斷不符，在分子診斷的指導(dǎo)下，重新分類了2例患者的臨床診斷[11]。Zhao等[12]將來(lái)自北愛爾蘭的大量RP先證者應(yīng)用于新一代基于測(cè)序的全面分子診斷的研究，研究表明分子信息可以幫助臨床診斷，可能幫助改變治療方案，并可用于家庭咨詢和管理。

3光感受器凋亡的途徑

視網(wǎng)膜中光感受器細(xì)胞有視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞2種，它們的凋亡是不同致病基因?qū)е翿P最終的共同機(jī)制。不同的基因缺陷可能通過(guò)以下途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]：(1)遺傳缺陷導(dǎo)致光感受器外節(jié)的正常結(jié)構(gòu)不能形成或脫落，打破之間的平衡，影響正常的RPE與感光細(xì)胞間代謝物質(zhì)的傳遞；(2)基因缺陷導(dǎo)致光電轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，現(xiàn)在更多觀點(diǎn)認(rèn)為該途徑紊亂, 引起高濃度cGMP, 作為信號(hào)分子介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡；(3)基因缺陷影響RPE與光感受器的相互作用, 如視黃醛再生和RPE 對(duì)外節(jié)的內(nèi)化、分解；(4)相鄰細(xì)胞之間誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，一些RP致病基因是在視桿細(xì)胞而不在視錐細(xì)胞中,但最終表現(xiàn)為視錐、視桿細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制目前尚不明確，可能與凋亡細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，或營(yíng)養(yǎng)因子消失有關(guān)。Ma等[13]發(fā)現(xiàn)變性的光感受器可通過(guò)旁觀者效應(yīng)擴(kuò)散至周圍健康的細(xì)胞，錐體細(xì)胞對(duì)錐體細(xì)胞也具有殺傷作用。

4 RP的治療

4.1基因治療基因治療是把目的基因經(jīng)載體轉(zhuǎn)至有基因缺陷的細(xì)胞內(nèi)來(lái)替代致病基因的治療手段。基因治療的方法主要有以下4種。

4.1.1基因替代治療MFRP編碼未知功能的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)特異性膜受體。rd6小鼠是由Mfrp(膜型卷曲相關(guān)蛋白)基因突變引起的常染色體隱性遺傳的RP的天然模型，Dinculescu 等[14]應(yīng)用酪氨酸-衣殼突變體scAAV8(Y733F)作為載體將目的基因?qū)雛d6小鼠的視網(wǎng)膜下，發(fā)現(xiàn)對(duì)維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能均有效，且對(duì)于減緩光感受器變性以及防止異常吞噬細(xì)胞在視網(wǎng)膜下的特征性積聚也是有效的。Li等[15]為了防止Mfrprd6小鼠中的光感受器細(xì)胞死亡，在出生后第5d通過(guò)視網(wǎng)膜下注射AAV-Mfrp載體將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至右眼，左眼作為對(duì)照組，通過(guò)EGR檢測(cè)，右眼的視錐和視桿細(xì)胞的功能較左眼顯著增加，且右眼視網(wǎng)膜外核層厚度較左眼增加。以上2個(gè)實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明基因治療是有效的，但目前多數(shù)研究都還只基于動(dòng)物模型中。

4.1.2 RNA干擾技術(shù)RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的，在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平封鎖相應(yīng)基因表達(dá)的新基因阻斷技術(shù)，在基因功能研究、基因治療方面已顯示出巨大的前景[16]，可用于抑制體外和體內(nèi)特定基因的表達(dá)。對(duì)于其他組織及器官來(lái)說(shuō)，眼球是相對(duì)密閉的，因此，目前認(rèn)為眼睛是RANi治療的一個(gè)好靶點(diǎn)，可通過(guò)局部眼藥水點(diǎn)眼或注射遞送干擾RNA。Hernan 等[17]研究發(fā)現(xiàn)siRNA可能干擾順式作用剪接RHO轉(zhuǎn)錄物，在常染色體顯性遺傳的治療方法中應(yīng)該考慮突變序列和不完全突變轉(zhuǎn)錄物消除的限制。

4.1.3核酶治療RP核酶是一類具有催化活性的RNA分子，通過(guò)催化靶位點(diǎn)RNA鏈中磷酸二酯鍵的斷裂，特異性地剪切底物RNA分子，從而阻斷靶基因的表達(dá)。Dir等發(fā)現(xiàn)核酶可區(qū)分與常染色體顯性RP相關(guān)的mRNA的突變型和野生型序列，同時(shí)描述了根據(jù)核酶切割的動(dòng)力學(xué)和特異性它們會(huì)減少視桿細(xì)胞中異常視紫紅質(zhì)的量并且可能具有作為抗遺傳疾病的治療劑的潛力[18]。

4.1.4抑制凋亡RP最終的表現(xiàn)是RPE細(xì)胞功能喪失和光感受器的凋亡，因此通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡可能會(huì)延緩或阻止病情的進(jìn)展。Bcl-2基因即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因，是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并且近年來(lái)的一些研究已開始揭示這一作用的機(jī)制。Nir等[18]將Bcl-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至RP小鼠模型及rds小鼠中，觀察到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，前者光感受器的數(shù)量是后者的2倍，表明Bcl-2表達(dá)可能是人類視網(wǎng)膜色素變成有效的治療策略。

4.2細(xì)胞移植目前細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性是眼科研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)報(bào)道將感光前體細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔或玻璃體內(nèi),具有延緩光感受器的凋亡或替代凋亡的感光細(xì)胞的作用以挽救殘存的視覺功能及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。主要的移植細(xì)胞來(lái)源是視網(wǎng)膜祖/干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPS)[19]，其中胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是多能的，可變?yōu)槿魏我环N細(xì)胞。ESC來(lái)源于胚胎，而IPS細(xì)胞可來(lái)自各種組織，如皮膚、骨髓、牙齒。Li等[20]成功培養(yǎng)了來(lái)自成年小鼠的視網(wǎng)膜多能干細(xì)胞(RSC)，當(dāng)把培養(yǎng)的視網(wǎng)膜多能干細(xì)胞移植到緩慢退化的rd7突變小鼠眼睛的視網(wǎng)膜下間隙后，他們發(fā)現(xiàn)RSC衍生的感光細(xì)胞可整合到視網(wǎng)膜中，且形態(tài)學(xué)上類似于內(nèi)源性光感受器并與視網(wǎng)膜神經(jīng)元形成突觸，當(dāng)移植到光感受器缺陷型rd1突變小鼠(RP模型)的眼中時(shí)，RSC衍生的光感受器可部分恢復(fù)光響應(yīng)，表明RSC衍生的光感受器是功能性的，因此這項(xiàng)研究已經(jīng)證明，從成年小鼠視網(wǎng)膜分離的RSC具有產(chǎn)生功能性感光細(xì)胞的潛力，這些功能性感光細(xì)胞可以恢復(fù)RP和ARMD中光感受器細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的視力喪失。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道視網(wǎng)膜下移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有抑制視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡的作用，原因可能是通過(guò)其分泌的 bFGF 細(xì)胞因子發(fā)揮多向分化潛能及營(yíng)養(yǎng)支持的作用， 從而對(duì)光感受器細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用[21]。

4.3視網(wǎng)膜假體視網(wǎng)膜假體根據(jù)視網(wǎng)膜電極放置的位置又可以分為：視網(wǎng)膜上假體、視網(wǎng)膜下假體和脈絡(luò)膜上腔假體。美國(guó) Second Sight公司研發(fā)的Argus系列視覺假體是目前最有代表性的一類視網(wǎng)膜上假體[22-23]。Argus II 假體在2011 年、2013 年和 2014 年分別獲得歐盟、美國(guó)和加拿大FDA 的批準(zhǔn)用于治療晚期RP患者，它是全球使用最廣泛的視網(wǎng)膜假體，具有迄今為止估計(jì)有250多例患者接受了植入。有文獻(xiàn)報(bào)道殘余視力為光感的患者可通過(guò)ArgusⅡ系統(tǒng)識(shí)別字母和單詞，表明可再現(xiàn)的空間分辨率，但仍有許多復(fù)雜的工程和生物物理障礙需要克服，人工視覺和自然視覺之間仍然存在的很大的差距[22]。

4.4藥物治療在視網(wǎng)膜中維生素A通過(guò)衍生物——視黃醛與視蛋白結(jié)合形成視紫紅質(zhì), 參與光電轉(zhuǎn)化反應(yīng), 產(chǎn)生視覺沖動(dòng)。國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)均報(bào)道過(guò)維生素A可減慢RP的病情進(jìn)展。Berson等[24]對(duì)維生素A治療兒童RP進(jìn)行回顧性研究，結(jié)果顯示維生素A棕櫚酸酯可減緩視網(wǎng)膜色素變性兒童視錐細(xì)胞功能喪失。二十二碳六烯酸(DHA)、?；撬?、中藥治療RP均有報(bào)道過(guò)，但治療效果尚不明確。

4.5手術(shù)聯(lián)合藥物治療董玉萍等[25]對(duì)450例900眼RP患者應(yīng)用雙眼自體血管取材側(cè)支循環(huán)建立術(shù)同時(shí)聯(lián)合給予抗菌素、曲克蘆丁、三磷酸腺苷，口服卵磷脂絡(luò)合碘片、樂(lè)丁、遞法明等藥物治療，取得了一定的治療效果。

4.6 RP合并黃斑水腫的治療RP偶爾會(huì)伴有脈絡(luò)膜新生血管(CNV)和黃斑囊樣水腫(CME)，可使RP復(fù)雜化，發(fā)生在10%～50%的患者中[26]。主要機(jī)制為：(1)血視網(wǎng)膜屏障的破壞;(2)RPE中泵功能缺失;(3)Müller細(xì)胞功能水腫和障礙；(4)抗視網(wǎng)膜抗體;(5)玻璃體牽拉。近年來(lái)隨著抗VEGF藥物的出現(xiàn)，有研究者發(fā)現(xiàn)其治療RP繼發(fā)的CME可有效減輕水腫，Manabu[27]對(duì)1例56歲的患者進(jìn)行了連續(xù)8a的抗VEGF藥物治療，期間未觀察到視野進(jìn)行性喪失。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究[28]報(bào)道對(duì)6例10眼RP合并CME患者進(jìn)行雷珠單抗注射，9眼黃斑區(qū)多焦電生理的峰值術(shù)后恢復(fù)至正常水平,1眼改變不明顯。隨訪期間2眼有一過(guò)性眼壓升高,余未見其他并發(fā)癥發(fā)生。也有研究者提出RPE細(xì)胞可分泌VEGF，RP合并CME的患者應(yīng)慎用抗VEGF藥物,因此關(guān)于抗 VEGF對(duì)RP繼發(fā)的CME治療的安全性仍需要進(jìn)一步評(píng)估。因自身免疫反應(yīng)也可參與RP繼發(fā) CME，故糖皮質(zhì)激素對(duì)該病可能也會(huì)起到一定的作用。Alhassan 等[29]對(duì) 1 例應(yīng)用碳酸酐酶抑制劑治療無(wú)效的患者，實(shí)施雙眼玻璃體腔內(nèi)注入地塞米松后，患者BCVA及黃斑中心凹厚度均得到改善，但在治療后的2mo患者病情復(fù)發(fā)。

5小結(jié)

RP是眼科中常見的遺傳性眼病，目前發(fā)病機(jī)制及治療方法仍處于探索的過(guò)程中，雖然各種治療方法均有報(bào)道，但許多都還只是在動(dòng)物模型上研究得到的結(jié)論，要想用于臨床治療人類RP，可能還要經(jīng)過(guò)一段很長(zhǎng)并坎坷的路。要想攻克RP這一遺傳性眼病，不僅需要眼科醫(yī)生的不懈努力，也需要遺傳學(xué)家、流行病學(xué)家等的付出，更關(guān)鍵的是他們之間的合作與交流。