陳 平，劉曉莉，馬婧，喬德才

（1.北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875；2.吉首大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；3.國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是由于黑質(zhì)致密部（substantia nigra pars compacta，SNc）多巴胺（dopamine，DA）能投射嚴(yán)重丟失，導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)（basal ganglia，BG）運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能紊亂而引發(fā)的一種緩慢進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)退變疾?。˙astide et al.，2015），該疾病的主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙。目前臨床尚無(wú)治愈PD的有效療法，患者隨病情加重會(huì)完全喪失自主行為能力，直接影響了老年人的日常生活。近年來(lái)，學(xué)者開(kāi)始關(guān)注運(yùn)動(dòng)對(duì)PD的防治效果，發(fā)現(xiàn)身體活動(dòng)水平與PD發(fā)病間存在一定關(guān)聯(lián)（Hou et al.，2017），適當(dāng)?shù)纳眢w活動(dòng)可顯著改善PD患者的步態(tài)、平衡、協(xié)調(diào)等行為功能（Herman et al.，2007）。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究也證實(shí)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)PD模型大鼠行為功能障礙有明顯改善作用，其神經(jīng)機(jī)制與運(yùn)動(dòng)促進(jìn)內(nèi)源性大麻素（endocannabinoids，eCB）配體合成，減輕紋狀體神經(jīng)元胞外谷氨酸（glutamine，Glu）過(guò)度增高引起的興奮性毒作用（林湘明 等，2017），抑制皮層-紋狀體Glu能突觸傳遞效能（陳巍等，2015b），糾正基底神經(jīng)節(jié)直接通路與間接通路的功能失衡有關(guān)（趙剛等，2020）。此外還發(fā)現(xiàn)，DA耗竭導(dǎo)致PD模型大鼠紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）樹(shù)突棘脫落與運(yùn)動(dòng)功能障礙出現(xiàn)具有相關(guān)性，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)可使PD模型大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘密度顯著增加，并伴隨著運(yùn)動(dòng)功能障礙的顯著改善，推測(cè)紋狀體MSNs形態(tài)可塑性可能在運(yùn)動(dòng)改善PD模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙中起重要作用（陳巍等，2015a）。MSNs約占紋狀體神經(jīng)元的95%，由于受體表達(dá)的特異性可分為2種亞型：表達(dá)多巴胺I型受體（do‐pamine1type receptors，D1R）的D1-MSNs和表達(dá)多巴胺型II受體（dopamine 2 type receptors，D2R）的D2-MSNs，它們分別調(diào)控基底神經(jīng)節(jié)直接通路與間接通路的功能。PD狀態(tài)下，DA耗竭引起紋狀體D2-MSNs過(guò)度激活，被認(rèn)為是導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)功能紊亂的主要原因之一；那么，紋狀體MSNs樹(shù)突棘運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性是否也可能選擇性地發(fā)生在D2-MSNs，尚缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。為此，本研究試圖采用逆行神經(jīng)示蹤的方法，分別用熒光標(biāo)記D1-MSNs和D2-MSNs，證實(shí)PD模型大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性發(fā)生的可能細(xì)胞靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重240±10 g（8周齡），購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0007］。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，12/12 h晝夜循環(huán)，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度控制在20℃～25℃，相對(duì)濕度為50%±10%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)北京師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，還按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道主義關(guān)懷。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)安靜組（Con組，n=12）、模型組（n=32）；模型組經(jīng)鑒定符合PD模型的大鼠隨機(jī)分為PD組和PD運(yùn)動(dòng)組（PD＋Ex組）；各組再分為2個(gè)亞組，即D1-MSNs/D2-MSNs標(biāo)記的安靜對(duì)照組（Con＋D1-MSNs組）/（Con＋D2-MSNs組），D1-MSNs/D2-MSNs標(biāo)記的6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）安靜組（PD＋D1-MSNs組）/（PD＋D2-MSNs組），D1-MSNs/D2-MSNs標(biāo)記的6-OHDA運(yùn)動(dòng)組（PD＋Ex＋D1-MSNs組）/（PD＋Ex＋D2-MSNs組）。

1.2 PD模型的制備與評(píng)價(jià)方法

1.2.1 PD模型大鼠的制備

大鼠禁食24 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠。俯臥位將頭固定于可調(diào)節(jié)的大鼠腦立體定位儀上，并用控溫加熱墊保持大鼠體溫（37℃），充分暴露前后囟使之保持在同一水平面上。參照Paxionos等（1997）大鼠腦定位圖譜確定右腦內(nèi)側(cè)前腦束（medial forebrain bundle，MFB）坐標(biāo)（AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，H：7.6～7.8 mm）作為6-OHDA注射點(diǎn)，將6-OH‐DA 溶于含 0.02% 抗壞血酸生理鹽水中（2 μg/μL），以1 μL/min 勻速給藥，藥物總量為 8 μg/4 μL，注射完畢留針5～10 min，緩慢退針。Con組大鼠在相同注射點(diǎn)給予等量含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。手術(shù)完成待清醒后放置籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 PD模型大鼠的評(píng)價(jià)方法

藥物誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為實(shí)驗(yàn)在6-OHDA注射后第7天實(shí)施，分別對(duì)各組大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡（apomor‐phine，APO，0.5 mg/kg）誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為實(shí)驗(yàn)，記錄30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。本研究篩選凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)）的差值＞100 r/30 min作為PD大鼠模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)（Jia et al.，2009），剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠。

1.2.3 黑質(zhì)、紋狀體酪氨酸羥化酶表達(dá)水平檢測(cè)

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100g）麻醉，依次經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的生理鹽水（250 mL）和多聚甲醛（4 g/L，300 mL），斷頭取腦組織放入固定液中固定24 h，轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液至沉底，修塊，包埋。參照Paxionos等（1997）大鼠腦立體定位圖譜確定紋狀體和黑質(zhì)位置，連續(xù)冠狀切片，每隔3張選取1張切片在0.01 M的PBS（PH 7.4）中漂洗后，室溫下置于0.3% Triton X-100的PBS中破膜30 min，3% H2O2中孵育10 min，PBS漂洗；腦片轉(zhuǎn)入5%山羊血清的PBS中室溫孵育1 h，鼠抗TH單抗隆抗體（1∶3 000）（Sigma，USA）孵育過(guò)夜；PBS漂洗3次后，室溫下生物素化兔抗孵育1 h，親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC-Elitekit，Vector Laborato‐ries，USA）孵育1 h，PBS漂洗3次，DAB溶液中顯色10～20 s。采用Olympus-DP72型顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxxylase，TH）平均光密度，判斷DA能神經(jīng)元的損毀情況。

1.3 D1-MSNs/D2-MSNs胞體逆行示蹤

6-OHDA注射完畢后，參照Paxionos等（1997）確定蒼白球內(nèi)側(cè)部（globus pallidum internus，GPi）（BP：2.3 mm，R：2.8 mm，H：8.0 mm）、蒼白球外側(cè)部（globus pallidum ex‐ternal segment，GPe）（BP：1.3 mm，R：3.2 mm，H：6.5 mm）坐標(biāo)，牙科鉆鉆孔，用微量注射泵將Retro-beads（注射計(jì)量為 500 nL，速度 50 nL/min）分別注入 GPi和 GPe（圖 1）。注射完畢后均留針10 min，緩慢退針。用生物硅膠填充顱骨孔，醫(yī)用碘伏和明膠海綿消毒止血后，縫合傷口，并用青霉素敷于傷口表面預(yù)防感染；待清醒后放置籠內(nèi)，單籠飼養(yǎng)。

圖1 D1-MSNs/D2-MSNs胞體逆行標(biāo)記病毒注射位點(diǎn)（Gerfen et al.，2010）Figure 1.Virus Injection Sites of D1-MSNs/D2-MSNs Soma Retrograde Tracing

1.4 行為學(xué)測(cè)試

采用爬桿實(shí)驗(yàn)（pole test）評(píng)價(jià)大鼠四肢運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)性（Tajiri et al.，2010）。爬桿（高60 cm，直徑0.7 cm）用醫(yī)用紗布纏好，保證有足夠的摩擦力；將大鼠頭端朝下置于桿頂，記錄大鼠從桿頂爬至桿底平面所需時(shí)間。每只大鼠測(cè)試3次，每次間隔5 s，取平均值。測(cè)試前引導(dǎo)每只大鼠自桿頂爬至桿底面，進(jìn)行2次適應(yīng)性訓(xùn)練。

1.5 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

術(shù)后1周，采用Tajiri等（2010）建立的運(yùn)動(dòng)方案，對(duì)PD＋Ex組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。訓(xùn)練方案為：11 m/min，30 min/d，5 d/w，共4周（周六、日休息）。運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間為訓(xùn)練日下午16∶00—18∶00。Con組與PD組大鼠在相同時(shí)間段置于跑臺(tái)內(nèi)，但不進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，使其處于自然安靜狀態(tài)。

1.6 D1-MSNs/D2-MSNs的熒光標(biāo)記

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉后處死，迅速取腦，振動(dòng)切片（300 μm），腦片放入34.5℃的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中孵育1 h；在膜片鉗顯微鏡的紫外光激發(fā)下可以觀察到被Retro‐beads逆行標(biāo)記的紋狀體蒼白球內(nèi)側(cè)部或紋狀體蒼白球外側(cè)部（Str-GPi或Str-GPe）神經(jīng)元的胞體（圖2）。用加入biocytin的電極內(nèi)液鉗制Retrobeads標(biāo)記的神經(jīng)元胞體，約patch 15～30 min，撤出電極，將腦片在含有4%PFA的PBS溶液中固定過(guò)夜（4℃），PBS洗10 min×3，0.5%triton破膜30 min，5%BSA 1 h，加入Avidin 555室溫孵育2 h，PBS洗10 min×3；激光共聚焦掃描顯微鏡下拍照。

圖2 D1-MSNs或D2-MSNs胞體逆行示蹤標(biāo)記Figure 2.D1-MSNs or D2-MSNs Cytosolic Retrograde Tracing

1.7 免疫印跡（Western blot）檢測(cè)PSD-95和Syn蛋白

大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，斷頭取腦，迅速于冰面上剝離雙側(cè)紋狀體。加入適量組織裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）超聲裂解，提取總蛋白；用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，加入5×SDS上樣緩沖液，于沸水中煮5 min，冰上冷卻，置于-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取蛋白樣?0 μg經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至硝化纖維素膜上，室溫下封閉1 h后，使用以下主要抗體對(duì)PSD-95和Syn進(jìn)行檢測(cè)：鼠 anti-PSD-95 IgG（1∶10 000，EMD Milli‐pore，Billerica，MA），兔 anti-Syn IgG（1∶5 000，Vector Lab‐oratory，Inc.，Burlingame，CA）。主要抗體用含有 2% 的NGS和0.05%TX進(jìn)行稀釋。組織在抗體溶液中4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜后，TBS清洗3次。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗 抗 體（1∶2 000；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）作為二抗，37℃孵育過(guò)夜；洗后再轉(zhuǎn)移到ECL化學(xué)發(fā)光顯色液中，曝光后顯影、定影，最后掃描并圖像分析；計(jì)算目的條帶PSD-95和Syn蛋白的吸光度值。為減少個(gè)體差異，以該大鼠損傷側(cè)吸光度值/未損傷側(cè)吸光度值的比值表示PSD-95和Syn蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.8 樹(shù)突棘密度分析

用于分析的MSNs入選標(biāo)準(zhǔn)為：胞體為圓形或卵圓形，有3～8個(gè)1級(jí)樹(shù)突。在Olympus激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察MSNs樹(shù)突棘的密度，由于各級(jí)樹(shù)突上樹(shù)突棘的分布不均勻，因此，從神經(jīng)元胞體發(fā)出樹(shù)突的第1次分支開(kāi)始，計(jì)算30～60 μm長(zhǎng)度范圍內(nèi)樹(shù)突棘的個(gè)數(shù)，再計(jì)算其樹(shù)突棘的密度（每10 μm長(zhǎng)度范圍內(nèi)樹(shù)突棘個(gè)數(shù)）。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，采用GraphPad Prism 6軟件作圖。組間均值的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），選擇LSD檢驗(yàn)對(duì)組間均值進(jìn)行差異性比較；采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析（Repeated measure two-way ANOVA）比較組內(nèi)各指標(biāo)隨時(shí)間變化；采用卡方檢驗(yàn)比較組間百分比指標(biāo)的差異性；以P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 PD大鼠模型可靠性評(píng)價(jià)

6-OHDA注射后第7天對(duì)大鼠進(jìn)行APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)，結(jié)果表明，6-OHDA損毀大鼠共32只，旋轉(zhuǎn)次數(shù)＞100 r/30 min（167.68±16.23 r/30 min）的共計(jì)24只，成模率75%，未達(dá)到模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠剔除（圖3）。

圖3 APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果及PD大鼠成模率Figure 3.Results of Apo-Induced Rotation Test and PD Molding Rate

最后1周行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，對(duì)紋狀體和黑質(zhì)進(jìn)行取材并做免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，Con組雙側(cè)黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均勻且對(duì)稱(chēng)分布，雙側(cè)紋狀體TH免疫陽(yáng)性纖維終末含量均勻、密集、對(duì)稱(chēng)；PD組損毀側(cè)黑質(zhì)（右側(cè)）TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及損毀側(cè)紋狀體（右側(cè)）TH免疫陽(yáng)性纖維終末含量均出現(xiàn)嚴(yán)重丟失，雙側(cè)黑質(zhì)、紋狀體TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)、免疫陽(yáng)性纖維終末含量均呈現(xiàn)明顯的不對(duì)稱(chēng)性。與Con相比，PD組大鼠黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、紋狀體TH免疫陽(yáng)性纖維終末含量均顯著降低（P＜0.01）；與PD組相比，PD＋Ex組大鼠黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、紋狀體TH免疫陽(yáng)性纖維終末含量均無(wú)顯著改變（P＞0.05）（圖4）。

圖4 黑質(zhì)與紋狀體TH免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果Figure 4.Results of TH Immunostaining in SNc and Striatum

2.2 各組大鼠四肢協(xié)調(diào)能力的比較

爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con組大鼠爬桿過(guò)程中四肢并用，動(dòng)作協(xié)調(diào)，能夠一次性順利從桿頂爬下；PD組大鼠爬桿過(guò)程中表現(xiàn)為笨拙、恐懼、抓桿不能，甚至有掉落現(xiàn)象，從桿頂爬至桿底的延遲時(shí)間較Con組顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；PD＋Ex組大鼠爬桿過(guò)程中表現(xiàn)為螺旋向下爬行，四肢抱緊桿，有間歇停頓現(xiàn)象，自桿頂爬至桿底的延遲時(shí)間較PD組顯著縮短（P＜0.05）（圖5B）。

對(duì)各組大鼠各周四肢協(xié)調(diào)能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明，與第0周相比，Con組大鼠各周爬桿延遲時(shí)間無(wú)顯著變化（P＞0.05）；PD組大鼠各周爬桿延遲時(shí)間隨著6-OHDA毒素?fù)p傷時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.01）；PD＋Ex組大鼠各周爬桿延遲時(shí)間也表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，自第2周開(kāi)始均低于PD組，第4周時(shí)呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），第5周時(shí)降低更加顯著（P＜0.01），存在明顯的時(shí)序性變化（圖5C）。

圖5 各組大鼠四肢協(xié)調(diào)能力的比較Figure 5.The Comparision of Movement Coordination in Each Group

2.3 各組大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘密度的比較

激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察紋狀體MSNs樹(shù)突棘密度發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，PD組和PD＋Ex組大鼠D1-MSNs樹(shù)突棘密度無(wú)顯著改變（P＞0.05）；與Con組相比，PD組D2-MSNs大鼠樹(shù)突棘密度顯著降低（P＜0.01）。與PD組相比，PD＋Ex組D2-MSNs樹(shù)突棘密度顯著增加（P＜0.05）（圖6）。

圖6 各組大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘密度的比較Figure 6.Effect of Exercise Intervention on the Density of Msns Dendritic Spines of Triatum

2.4 各組大鼠D1-MSNs/D2-MSNs形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

Sholl分析結(jié)果顯示，PD組與Con組相比、PD＋Ex組與PD組相比，大鼠D1-MSNs和D2-MSNs一級(jí)樹(shù)突分支數(shù)量、胞體面積、樹(shù)突總分支數(shù)量和樹(shù)突分支總長(zhǎng)度均無(wú)顯著改變（P＞0.05，P＞0.05）（圖7、圖8）。

圖7 紋狀體MSNs Sholl分析模式圖Figure 7.Pattern MSNs Sholl Analysis of Striatum

圖8 各組大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突分支、樹(shù)突分支總長(zhǎng)度及胞體面積比較Figure 8.Analysis of The Branch of Dendrite，Total Length and Cell Area of the MSNs in Striatum of Rats

2.5 各組大鼠紋狀體PSD-95、Syn蛋白表達(dá)水平比較

免疫印跡結(jié)果顯示，與Con組相比，PD組大鼠紋狀體PSD-95表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與PD組相比，PD＋Ex組大鼠紋狀體PSD-95表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。與Con組相比，PD組大鼠紋狀體Syn表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與PD組相比，PD＋Ex組大鼠紋狀體Syn表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖9）。

圖9 各組大鼠紋狀體PSD-95、Syn蛋白表達(dá)水平比較Figure 9.Expression of PSD-95 and Syn Protein in the Striatum of Rats

3 討論

樹(shù)突棘是構(gòu)成記憶存儲(chǔ)和突觸傳遞的解剖學(xué)基礎(chǔ)，具有很強(qiáng)的可塑性。在生命的整個(gè)周期中，哺乳動(dòng)物大腦中神經(jīng)元樹(shù)突棘的數(shù)量和密度會(huì)隨著發(fā)育的進(jìn)展出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病或豐富環(huán)境均可能引起樹(shù)突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，并影響突觸的可塑性。

3.1 PD狀態(tài)下紋狀體MSNs樹(shù)突棘丟失

McNeill等（1988）、Stephens等（2005）和 Zaja-Milatovic等（2005）對(duì)PD患者的腦組織進(jìn)行尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紋狀體MSNs樹(shù)突和樹(shù)突棘存在萎縮或丟失現(xiàn)象。Nishijima等（2013）采用免疫電鏡技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，6-OHDA偏側(cè)損毀模型大鼠去DA神經(jīng)支配后紋狀體樹(shù)突棘的數(shù)量、密度顯著降低。Zhang等（2013）發(fā)現(xiàn)，6-OHDA偏側(cè)損毀模型大鼠紋狀體MSNs胞體遠(yuǎn)端和近端樹(shù)突上的樹(shù)突棘大約丟失40%。Soderstrom等（2010）采用Golgi染色的方法也得到了類(lèi)似的結(jié)果。Suarez等（2014）和Antzoulatos等（2011）采用Golgi染色和免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PD模型小鼠紋狀體MNSs樹(shù)突長(zhǎng)度、分枝數(shù)量及樹(shù)突棘數(shù)量、密度均顯著降低；Villalba等（2011）和Smith等（2009）利用Golgi染色技術(shù)結(jié)合3D電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，非人靈長(zhǎng)類(lèi)PD模型紋狀體MSNs樹(shù)突棘丟失30%～50%。此外，有研究采用免疫組織化學(xué)結(jié)合超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，皮層與紋狀體MSNs樹(shù)突棘相突觸的軸-棘突觸體積增大，Glu能突觸后致密區(qū)（PSD）厚度和穿通型突觸數(shù)量增加，突觸前Glu能軸突終端增大，這些形態(tài)變化是Glu能突觸傳遞增強(qiáng)的解剖學(xué)基礎(chǔ)，也代償MNSs樹(shù)突棘的丟失（Villalba，2009；Villalba et al.，2011）。然而，Day等（2006）利用細(xì)菌人工染色體（BACs）作為克隆載體，建立增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）標(biāo)記多巴胺Ⅰ型受體（D1DR）和多巴胺Ⅱ型受體（D2DR）的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，給予利魯平處理后發(fā)現(xiàn)，DA耗竭可使紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘數(shù)量明顯減少，而D1-MSNs樹(shù)突棘數(shù)量無(wú)顯著改變。本研究采用逆行神經(jīng)示蹤技術(shù)分別標(biāo)記D1-MSNs和D2-MSNs，利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到，PD模型大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘脫落的部位主要發(fā)生在D2-MSNs，而D1-MSNs樹(shù)突棘密度未出現(xiàn)顯著減少這與Day等（2006）利用轉(zhuǎn)基因PD模型小鼠獲得的研究結(jié)果相同；通過(guò)Sholl分析發(fā)現(xiàn)，PD模型大鼠紋狀體D1-MSNs和D2-MSNs一級(jí)樹(shù)突分支數(shù)量、總樹(shù)突分支數(shù)量、樹(shù)突長(zhǎng)度以及胞體面積均未顯著改變。Kim等（2013）采用Golgi染色及電鏡觀察樹(shù)突分支，發(fā)現(xiàn)PD模型小鼠紋狀體MSNs樹(shù)突分支長(zhǎng)度和總樹(shù)突分支數(shù)量呈顯著降低。推測(cè)導(dǎo)致上述結(jié)果不一致的原因與研究方法不同有關(guān)，逆行神經(jīng)示蹤熒光標(biāo)記方法能較好地保持神經(jīng)元活性，其結(jié)果較Golgi染色獲得的結(jié)果更真實(shí)可信。目前仍未完全闡明PD動(dòng)物紋狀體MSNs樹(shù)突棘丟失的確切機(jī)制，有研究認(rèn)為，可能與Glu興奮性毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等諸多因素有關(guān)（Villalba et al.，2010）。DA替代療法不能阻止PD狀態(tài)下紋狀體MSNs樹(shù)突棘丟失，說(shuō)明DA耗竭并不是導(dǎo)致紋狀體MSNs樹(shù)突棘形態(tài)改變的主要因素。Garcia等（2010）研究表明，用6-OHDA同時(shí)損毀黑質(zhì)與皮層可顯著降低由DA去神經(jīng)支配導(dǎo)致的紋狀體MSNs樹(shù)突棘丟失。Neely等（2007）發(fā)現(xiàn)，給予mGluR2/3激動(dòng)劑抑制皮層-紋狀體突觸前Glu釋放可阻止PD狀態(tài)下MSNs樹(shù)突棘脫落。Day等（2006）利用免疫電鏡觀察證實(shí)，抑制紋狀體D2-MSNs上L-型鈣通道蛋白Cav1.3α活性或基因敲除Cav1.3α亞單位后D2-MSNs樹(shù)突棘脫落現(xiàn)象消失。上述結(jié)果表明，PD狀態(tài)下紋狀體MSNs樹(shù)突棘數(shù)量和密度的選擇性丟失可能主要與皮層-紋狀體突觸前Glu過(guò)度釋放導(dǎo)致的興奮性毒作用有關(guān)。

3.2 運(yùn)動(dòng)選擇性降低PD模型大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘丟失

樹(shù)突棘形態(tài)與結(jié)構(gòu)具有運(yùn)動(dòng)環(huán)境依賴(lài)可塑性。Petz‐inger等（2007）發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可增加PD模型小鼠紋狀體MSNs樹(shù)突分枝長(zhǎng)度、數(shù)量以及樹(shù)突棘密度。Toy等（2014）采用轉(zhuǎn)基因PD小鼠研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增跑臺(tái)訓(xùn)練后紋狀體D1-MSNs和D2-MSNs樹(shù)突棘和樹(shù)突分支數(shù)量均顯著增加，PSD-95和Syn表達(dá)水平顯著上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可使PD模型大鼠紋狀體MSNs樹(shù)突棘密度顯著增加，穿通型突觸數(shù)量顯著增多（陳巍等，2015a）。本研究利用神經(jīng)元逆行示蹤標(biāo)記方法進(jìn)一步研究證實(shí)，PD模型大鼠紋狀體樹(shù)突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性主要發(fā)生在D2-MSNs，支持了“PD模型大鼠紋狀體樹(shù)突棘形態(tài)運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性具有選擇性，作用的細(xì)胞靶點(diǎn)可能在D2-MSNs”的研究假設(shè)；也為本研究團(tuán)隊(duì)基于在體或離體電生理學(xué)技術(shù)證實(shí)“跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)降低皮層-紋狀體Glu通路的過(guò)度傳導(dǎo)并抑制D2-MSNs興奮性”的研究結(jié)論（趙剛 等，2019；Chen et al.，2017）提供了 新的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

PSD-95是定位于突觸后致密區(qū)的一種結(jié)構(gòu)錨定蛋白，參與突觸強(qiáng)度和突觸可塑性調(diào)節(jié)（Black et al.，1990）。Syn是定位于突觸前終端囊泡膜上的一種特異性膜蛋白（Takamatsu et al.，2010），是反映突觸類(lèi)型、突觸數(shù)量的重要蛋白分子標(biāo)記物（Hu et al.，2009）。Pagnussat等（2012）研究表明，體力活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)均可促進(jìn)海馬腦區(qū)的突觸形成；Hu等（2009）研究表明，運(yùn)動(dòng)促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)重塑與PSD-95蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Ribeiro等（2013）研究表明，適度運(yùn)動(dòng)增加黑質(zhì)和紋狀體腦區(qū)Syn表達(dá)和突觸后PSD厚度，促進(jìn)突觸傳遞及突觸可塑性。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)紋狀體突觸連接蛋白PSD-95和Syn蛋白表達(dá)，增加D2-MSNs樹(shù)突棘數(shù)量和密度，這為紋狀體MSNs運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性發(fā)生，進(jìn)而改善PD模型大鼠四肢協(xié)調(diào)性奠定了良好的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

3.3 運(yùn)動(dòng)選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘丟失的可能機(jī)制

運(yùn)動(dòng)選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘丟失的可能機(jī)制與運(yùn)動(dòng)降低皮層-紋狀體Glu突觸傳遞效能有關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)離體腦片膜片鉗場(chǎng)電記錄技術(shù)研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)或D2R激動(dòng)劑干預(yù)均可抑制D2-Cre小鼠PD模型皮層-紋狀體Glu突觸傳遞異常增高現(xiàn)象，推測(cè)D2R在運(yùn)動(dòng)降低皮層-紋狀體Glu突觸傳遞中起重要作用（趙剛等，2019）。D2R為G蛋白偶聯(lián)受體，激活D2R引起Gi/o蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，降低腺苷酸環(huán)化酶活性，使細(xì)胞膜電位超極化，抑制D2-MSNs興奮性。此外，運(yùn)動(dòng)選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘丟失的可能機(jī)制與運(yùn)動(dòng)降低皮層-紋狀體Glu通路的興奮性毒作用有關(guān)。Glu為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，PD狀態(tài)下皮層-紋狀體突觸前Glu大量釋放，激活突觸后膜D2-MSNs上受體門(mén)控和電壓門(mén)控鈣通道，引起Ca2＋內(nèi)流，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白及D2-MSNs樹(shù)突棘的形態(tài)與數(shù)量改變（陳平等，2017）。4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)通過(guò)上調(diào)紋狀體mGluR2/3表達(dá)，下調(diào)紋狀體MSNs膜上L-型電壓門(mén)控鈣通道Cav1.3亞基表達(dá)，降低了PD模型大鼠皮層-紋狀體Glu過(guò)度釋放介導(dǎo)的興奮性毒作用（Chen et al.，2017）。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，eCBs）介導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程抑制（eCB-LTD）是皮層-紋狀體突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式之一（Kluger et al.，2015），eCB-LTD僅特異性存在于D2-MSNs且受D2R調(diào)控（Lerner et al.，2012）。PD病理狀態(tài)下紋狀體D2-MSNs膜上D2R功能受損，引起下游G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子 4（regulator of G-protein signaling 4，RGS4）功能異常，從而抑制eCB配體合成，最終使eCB-LTD現(xiàn)象減弱或消失（Trusel et al.，2015）。4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)紋狀體RGS4活性促進(jìn)eCB配體（AEA/2-AG）合成，恢復(fù)皮層-紋狀體eCB-LTD突觸可塑性，調(diào)節(jié)突觸前Glu釋放水平，降低Glu的興奮性毒作用，這也是運(yùn)動(dòng)選擇性降低紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘丟失的又一因素（林湘明等，2017）。

4 結(jié)論

PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘丟失，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹(shù)突棘丟失。運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)突觸連接蛋白表達(dá)促進(jìn)PD模型大鼠紋狀體MSNs形態(tài)結(jié)構(gòu)重塑。紋狀體MSNs樹(shù)突棘發(fā)生運(yùn)動(dòng)依賴(lài)可塑性變化為PD模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的改善提供了必要的解剖學(xué)基礎(chǔ)。