胡智慧，李建芹，韓魯軍，張 靜，張紅欣

(1.石家莊市第一醫(yī)院 腫瘤科一病區(qū)， 河北 石家莊 050011; 2.黃驊市人民醫(yī)院 肌電圖室, 河北 滄州 061300)

異丙酚(propofol)是一種常用的靜脈麻醉劑。越來(lái)越多的證據(jù)表明異丙酚有許多非麻醉作用[1]。近年來(lái)，異丙酚被報(bào)道具有許多潛在的抗癌特性，如抑制癌細(xì)胞的增殖、黏附和轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。因此，異丙酚是癌手術(shù)中較好的麻醉劑。但關(guān)于異丙酚在肺癌細(xì)胞中的抗腫瘤活性的機(jī)制研究卻很少。丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)可催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，這是糖酵解途徑的最后一步[3]。PKM2的表達(dá)與食管鱗癌的耐藥有關(guān)，且與在非小細(xì)胞肺癌中的下調(diào)增加了放射敏感性有關(guān)[4]。本研究擬以肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973為研究對(duì)象，檢測(cè)其中PKM2的表達(dá)，觀察異丙酚、敲減PKM2、過表達(dá)PKM2對(duì)Anip973細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，揭示其機(jī)制可能與異丙酚抑制PKM2有關(guān)，將為異丙酚治療肺腺癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、Anip973(上海ATCC細(xì)胞庫(kù))；異丙酚(AstraZeneca公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶和MTT(Gibco公司)；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；PVDF膜(Roche公司)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(Corning公司)；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理： 將人肺腺癌細(xì)胞A549、Anip973用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至匯合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3的比例更換培養(yǎng)基，每2～3 d傳代1次。將正常培養(yǎng)的Anip973細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組。異丙酚(60、100和120 μmol/L)處理24 h的Anip973細(xì)胞標(biāo)記為0 μmol/L組、異丙酚60 μmol/L組、異丙酚100 μmol/L組、異丙酚120 μmol/L組；選擇最適濃度異丙酚120 μmol/L處理的Anip973細(xì)胞標(biāo)記為異丙酚組；將si-NC、si-PKM2、pcDNA3.1、pcDNA3.1-PKM2、異丙酚+pcDNA3.1、異丙酚+pcDNA3.1-PKM2按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書操作轉(zhuǎn)染至Anip973細(xì)胞，部分組用異丙酚120 μmol/L 處理，分別標(biāo)記為si-NC組、si-PKM2組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-PKM2組、異丙酚+pcDNA3.1組、異丙酚+pcDNA3.1-PKM2組，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：細(xì)胞中加入20 μL MTT(5 g/ L)溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度值(A)。細(xì)胞抑制率=[1-A490樣品/A490對(duì)照]×100%。細(xì)胞的增殖力與細(xì)胞活力成正比。

1.2.3 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲：將細(xì)胞以106個(gè)/孔接種于細(xì)胞6孔板，培養(yǎng)至匯合度75% 時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。調(diào)整細(xì)胞至105個(gè)/mL，取100 μL加入上室內(nèi)，600 μL含血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。

將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中PKM2的mRNA的表達(dá)：細(xì)胞遵照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書要求操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書操作合成cDNA。最后按RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行PKM2檢測(cè)。用2-△△Ct計(jì)算PKM2的表達(dá)。引物信息：PKM2(5′-3′)：上游引物CCATTACCAG CGACCCCACAG，下游引物GGGCACGTGGGCGGT ATCT；GAPDH(5′-3′)：上游引物TCCCTCAAGATT GCTAGCAA,下游引物AGATCCACAACGGATACATT。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PKM2、E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于離心管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的異丙酚對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549、Anip973增殖的影響

與異丙酚0 μmol/L組相比，異丙酚60 μmol/L組、異丙酚100 μmol/L組、異丙酚120 μmol/L組A549、Anip973細(xì)胞的抑制率均顯著升高(P<0.05)。選用對(duì)異丙酚較為敏感的Anip973做后續(xù)使用；選用作用時(shí)間24 h，抑制率約為50%作用的異丙酚濃度(120 μmol/L)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)(表1)。

表1 不同濃度異丙酚對(duì)細(xì)胞A549、Anip973增殖的影響Table 1 Effects of different concentrations of propofol on proliferation of A549 and Anip973 cells

*P<0.05 compared with propofol 0 μmol/L group.

2.2 異丙酚對(duì)肺腺癌細(xì)胞Anip973遷移、侵襲的影響

與對(duì)照組相比，異丙酚組Anip973細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高，MMP-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖1，表2)。

2.3 異丙酚對(duì)肺腺癌細(xì)胞Anip973中糖酵解途徑關(guān)鍵酶PKM2表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，異丙酚100 μmol/L組、異丙酚120 μmol/L組Anip973細(xì)胞中PKM2 mRNA和PKM2蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

A.Transwell assay(×200); B.expression of migration-related proteins圖1 異丙酚對(duì)細(xì)胞Anip973遷移、侵襲的影響Fig 1 Effects of propofol on migration and invasion of Anip973 cells

表2 異丙酚對(duì)細(xì)胞Anip973遷移、侵襲的影響Table 2 Effects of propofol on migration and invasion of Anip973

*P<0.05 compared with control group.

圖2 異丙酚對(duì)PKM2表達(dá)的影響Fig 2 Effects of propofol on PKM2 expression

表3 異丙酚對(duì)細(xì)胞Anip973中PKM2表達(dá)的影響Table 3 Effect of propofol on the expression of PKM2

*P<0.05 compared with control group.

2.4 抑制PKM2表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞Anip973增殖、遷移、侵襲的影響

與si-NC組相比，si-PKM2組Anip973細(xì)胞中PKM2、MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，24、48和72 h時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)(圖3，表4)。

圖3 PKM2及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of PKM2 and migration-related proteins

2.5 過表達(dá)PKM2能逆轉(zhuǎn)異丙酚對(duì)肺腺癌細(xì)胞Anip973增殖、遷移、侵襲的影響

與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PKM2組Anip973細(xì)胞中PKM2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高；與對(duì)照組相比，異丙酚組細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異；24、48和72 h時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低；與異丙酚+pcDNA3.1組相比，異丙酚+pcDNA3.1-PKM2組細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異；24、48和72 h時(shí)，細(xì)胞活性顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)(圖4,表5,6)。

3 討論

異丙酚雖為常用的麻醉劑，但近期大量研究報(bào)道其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用， 其中包括肺腺癌[5]。異丙酚可上調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-486的水平，呈劑量依賴性抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示異丙酚可能通過有效抑制肺癌細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而成為肺癌手術(shù)的理想麻醉劑[6]。異丙酚可抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制AQP-3和MMP-9的蛋白表達(dá)[7]。異丙酚可抑制肺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲，上調(diào)E-鈣粘蛋白，下調(diào)N-cadherin，vimentin和Snail表達(dá)[8]，此外，異丙酚還可促進(jìn)miR-1284的表達(dá)， 而抑制miR-1284可逆轉(zhuǎn)異丙酚誘導(dǎo)的細(xì)胞活力、遷移和侵襲的降低，并上調(diào)FOXM1表達(dá)，F(xiàn)OXM1敲低可通過異丙酚治療聯(lián)合miR-1284抑制降低細(xì)胞活力、遷移和侵襲，提示異丙酚可通過調(diào)節(jié)miR-1284抑制肺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力，遷移，侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程。本研究通過MTT法、Transwell小室法及RT-qPCR檢測(cè)異丙酚處理的肺腺癌細(xì)胞A549、Anip973發(fā)現(xiàn)，異丙酚可呈濃度依賴性抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，且最適濃度為120 μmol/L；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；深入研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可呈濃度依賴性上調(diào)PKM2的表達(dá)，推測(cè)異丙酚對(duì)肺腺癌細(xì)胞的作用與PKM2有關(guān)。

表4 抑制PKM2表達(dá)對(duì)細(xì)胞Anip973增殖、遷移、侵襲的影響Table 4 Effect of inhibition of PKM2 expression proliferation, migration and invasion of Anip973 cells n=6)

*P<0.05 compared with si-NC group.

圖4 遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 4 Expression of migration-related proteins

表5 PKM2 mRNA、蛋白的表達(dá) Table 5 Expression of PKM2 mRNA and protein

*P<0.05 compared with pcDNA3.1 group.

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是“華寶效應(yīng)”的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，催化磷酸烯醇丙酮酸去磷酸化為丙酮酸[9]。有4種PK同工酶，分別為L(zhǎng)、R、M1和M2。 L和R同種型主要在肝臟和紅細(xì)胞中表達(dá)[10]，而同工酶PKM1和PKM2最初來(lái)源于PKM基因[11]，在胚胎發(fā)生過程中，PKM2逐漸被PKM1取代。相反，PKM1在腫瘤發(fā)生期間明顯降低，而PKM2的表達(dá)增加。越來(lái)越多的證據(jù)表明PKM2活性與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，PKM2活性更有利于腫瘤細(xì)胞對(duì)促進(jìn)腫瘤增殖和侵襲以及維持腫瘤惡性表型相關(guān)[12]。PKM2在肺腺癌患者組織中的表達(dá)顯著升高，且與患者的低存活率關(guān)系密切，敲減PKM2可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲、葡萄糖攝取、ATP生成和脂肪酸合成、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)，而細(xì)胞的線粒體呼吸能力增加，闡明PKM2在細(xì)胞和分子水平上影響肺腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制是重要的，從而提供PKM2靶向基因治療開發(fā)所需的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[13]。

表6 過表達(dá)PKM2能逆轉(zhuǎn)異丙酚對(duì)細(xì)胞Anip973增殖、遷移、侵襲的作用Table 6 Over-expression of PKM2 reversed the proliferation, migration and invasion of propofol to Anip973 cells n=6)

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with propofol+pcDNA3.1 group.

PKM2的表達(dá)可增強(qiáng)致瘤性[14]，表明PKM2的激活劑可能具有抗腫瘤特性，并且PKM2激活劑可抑制肺腺癌細(xì)胞的體外增殖和裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，提示PKM2激活劑作為腫瘤細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)劑是有效的，具有肺癌和潛在的其他惡性腫瘤的抗腫瘤活性。本研究檢測(cè)了異丙酚處理的肺腺癌細(xì)胞Anip973中PKM2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，異丙酚可呈濃度依賴性抑制PKM2的表達(dá)，并且敲減PKM2可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與Parnell在肺癌中關(guān)于PKM2功能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖，這為PKM2在肺腺癌中的功能研究提供理論依據(jù)。深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PKM2可逆轉(zhuǎn)異丙酚對(duì)肺腺癌細(xì)胞Anip973增殖、遷移、侵襲的影響，這說(shuō)明不僅異丙酚可抑制PKM2的表達(dá)，反過來(lái)，PKM2也可逆向影響異丙酚對(duì)肺腺癌的功能研究。

綜上所述，異丙酚可抑制肺腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制也許與直接抑制PKM2表達(dá)有關(guān)，為異丙酚用于癌的治療提供依據(jù)。