曾 茜，詹 琪，高 遠，崔乃浩，馮魯乾

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科， 貴州 貴陽 550004)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種高致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,對家庭以及社會的穩(wěn)定性有惡性影響力[1-2]。SCI后神經(jīng)的修復和運動的改善主要還是在于保護殘存神經(jīng)元以及正向調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性[3]，但是神經(jīng)電刺激在關于保護神經(jīng)元以及調(diào)控神經(jīng)元可塑性的研究較少。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)由星形膠質(zhì)細胞分泌，對神經(jīng)元的存活、再生有重要作用[4]，巢蛋白(nestin) 是一種中間絲蛋白,多出現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期階段，目前研究表明nestin表達與軸突再生和神經(jīng)可塑性呈相關性[5]。為此，本實驗復制脊髓鈍挫傷(spinal cord contusion,SCC)大鼠模型，采用神經(jīng)電刺激在計劃的時間點進行干預，應用免疫組織化學染色技術(shù)及蛋白質(zhì)印跡檢測不同時段NGF與nestin表達的影響,以探討NGF與nestin在運動功能恢復過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠 90只，雌性，220～250 g[成都達碩實驗動物有限公司提供, 合格證號：SYXK(川)2014-189]。

1.1.2 主要實驗試劑以及儀器：兔SP試劑盒、羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)公司);NGF、nestin一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液、ECL化學發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；SZD-II 型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=6)、對照組(具體分為3、7和11 d組，每組n=6)和實驗組(具體分為3、7和11 d組，每組n=6)，根據(jù)不同的觀察技術(shù)亦可分為BBB評分(Basso, Beattie and Bresnahan Locomotor Rating Scale, BBB Sacle)組(n=18)、免疫組織化學染色技術(shù)組(n=36)和蛋白質(zhì)印記組(n=36)，免疫組化組和蛋白質(zhì)印記組分別在3、7和11 d取材。實驗組與對照組以Allen’s法復制大鼠脊髓損傷模型，即腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉大鼠(35 mg/kg)，俯臥位固定，在以神經(jīng)節(jié)段T9處作為中心，依次切開皮膚、筋膜及肌肉，隨后進行椎板切除術(shù)，暴露脊髓。選擇10 g金屬棒在30 mm處自由下落，實施脊髓鈍挫傷(SCC)，然后依次關閉肌肉、筋膜和皮膚。假手術(shù)組只進行椎板切除術(shù)，不實施打擊。

1.2.2 神經(jīng)電刺激的干預：術(shù)后24 h對實驗組進行電刺激干預，正極接在大鼠T7右側(cè)“夾脊穴”位置的皮膚，負極接在右下肢 “足三里穴”位置的皮膚。干預參數(shù)為：每天1次，刺激頻率10 Hz，疏密波脈沖電流，電流強度2.5 Hz，時長30 min。采用BBB評分法評估大鼠后肢運動情況。

1.2.3 免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)檢測：在對應的時間點進行大鼠心臟灌注，固定脊髓組織后制備石蠟切片(5 μm)，按兔SP試劑盒說明書進行免疫組化染色：烤片、脫蠟、水化、抗原修復，3% H2O2(過濾0.01 mol/L PBS配制)37 ℃封閉10 min，5%羊血清(用過濾0.01 mol/L PBS配制)37 ℃孵育25 min，加一抗(NGF，兔抗，1∶200；nestin，兔抗，1∶200)4 ℃過夜，漂洗:依次加試劑B及試劑C孵育。DAB顯色，0.01 mol/L PBS終止反應，復染、分色、反藍、脫水、封片。采用Motic光學顯微鏡400×視野下觀察不同組別以及不同時間點脊髓前角NGF和nestin陽性細胞分布并計數(shù)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測：0.9%氯化鈉溶液(4 ℃)快速心臟灌注后，以脊髓損傷點為中心取1 cm脊髓節(jié)段，加入RIPA裂解液常規(guī)研磨5 min，后在10 000 r/min離心15 min, 取上清在280 nm紫外光吸收法初步測定蛋白濃度，接著加入5×上樣緩沖液，在100 ℃加熱5 min以使蛋白質(zhì)變性。組裝電泳槽，點樣50 μg/孔，(SDS-PAGE)電泳，到溴酚藍接近玻璃板底部時關閉電源。取出膠塊轉(zhuǎn)膜，組裝轉(zhuǎn)膜槽，加電轉(zhuǎn)緩沖液， 在300 mA條件下電轉(zhuǎn)1.5 h。漂洗后5%羊血清封閉、一抗孵育4 ℃過夜。采用ECL化學發(fā)光試劑說明書進行底物顯色,然后進行凝膠成像，進行吸光度值測量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)電刺激促進大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復

與對照組相比，實驗組運動功能評分(BBB Scale)在SCC 7 d后就明顯上調(diào)(圖1)(P<0.05)。

2.2 神經(jīng)電刺激促進NGF和nestin陽性細胞的表達

與對照組相比，實驗組SCI后3 d 脊髓前角NGF和nestin陽性細胞數(shù)均顯著上調(diào)(P<0.05)，并且在7 d、11 d時NGF依舊呈強陽性表達(P<0.05)(圖2,3，表1)。

*P<0.05 compared with control group圖1 神經(jīng)電刺激促進大鼠脊髓鈍挫傷后的運動功能恢復Fig 1 Nerve electrical stimulation promoted motor function recovery of SCC rats

2.3 神經(jīng)電刺激對NGF和nestin蛋白表達水平的影響

與對照組相比，實驗組NGF在3 d表達迅速上調(diào)(P<0.05)，而且到11 d時實驗組NGF蛋白表達依舊處于較高水平(P<0.05)。總體上，實驗組nestin表達較對照組在3、7以及11 d均上調(diào)(P<0.05)(圖4，表2)。

3 討論

針刺療法在傳統(tǒng)中醫(yī)中具有十分悠久的應用歷史，本實驗中取夾脊穴和足三里穴作為研究點。另有研究取穴水溝穴、陽陵泉、風府穴等穴位，發(fā)現(xiàn)針刺療法具有抗感染、抗細胞毒性反應以及抗凋亡作用[6]。神經(jīng)電刺激不僅是穴位刺激，更是一種電磁場效應，能調(diào)動機體脊髓損傷后的自我修復程序和調(diào)控網(wǎng)絡，保護神經(jīng)元，提高神經(jīng)元的可塑性[7]。若將神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)放置于磁場中，可以發(fā)現(xiàn)nestin和Sox2的表達上調(diào)，而且還促進NSCs分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞/神經(jīng)膠質(zhì)細胞[8]，這種現(xiàn)象可能是由于磁場作用上調(diào)Wnt1和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路[9]，從而促進神經(jīng)干/祖細胞分化、神經(jīng)元增殖以及存活，這可能是本實驗中神經(jīng)電刺激改善脊髓鈍挫傷大鼠的運動功能的機制。

Nestin一般在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)上皮表達，若干/祖細胞分化成熟，nestin的表達會減弱甚至停止。但在成熟生物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)nestin在病理條件下上調(diào)，并且出現(xiàn)神經(jīng)干細胞自我更新[10]。外界機械損傷導致神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可能是由于小膠質(zhì)細胞活化，介導Jak/STAT信號通路，上調(diào)nestin的表達，從而影響祖細胞的增殖和分化[11]。本實驗觀察到神經(jīng)電刺激促進nestin的表達，因此神經(jīng)電刺激可提供了神經(jīng)干/祖細胞更新或者增殖的微環(huán)境，在源頭上保證了神經(jīng)元存活的數(shù)量。

A.expression of NGF in control group at 3 days; B.expression of NGF in control group at 7 days; C.expression of NGF in control group at 11 days; D.expression of NGF in experiment group at 3 days; E.expression of NGF in experiment group at 7 days; F.expression of NGF in experiment group at 11 days; Arrows indicated NGF positive products圖2 神經(jīng)電刺激促進脊髓前角NGF的表達Fig 2 Nerve electric stimulation promoted the expression of NGF in the anterior horn of the spinal cord (×400)

A.expression of nestin in control group at 3 days; B.expression of nestin in control group at 7 days; C.expression of nestin in control group at 11 days; D.expression of nestin in experiment group at 3 days; E.expression of nestin in experiment group at 7 days; F.expression of nestin in experiment group at 11 days; Arrows indicated nestin positive products圖3 神經(jīng)電刺激促進脊髓前角nestin的表達

groupNGFnestin3days7days11days3days7days11dayscontrol5.20±0.8312.18±0.577.16±1.2113.60±1.5223.60±0.897.20±1.84experiment12.40±1.14?21.19±1.23?11.58±0.91?23.40±1.82?35.20±1.48?11.40±1.67?

*P<0.05 compared with control group.

圖4 神經(jīng)電刺激對NGF和nestin蛋白表達水平的影響Fig 4 Effect of nerve electrical stimulation on the expression levels of NGF and nestin

表2 神經(jīng)電刺激對脊髓NGF和nestin蛋白相對表達水平的影響Table 2 Effects of nerve electric stimulation on NGF and nestin protein level in the spinal

*P<0.05 compared with control group.

NGF作為經(jīng)典的神經(jīng)營養(yǎng)素家族一員，主要通過與原肌球蛋白受體激酶A受體(Trk A)和泛神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)結(jié)合持續(xù)發(fā)揮生物學效應[12]。在本實驗中，神經(jīng)電刺激上調(diào)NGF的表達，可能是電磁場效應激活了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)，Ras /絲裂原活化蛋白激酶(Ras / MAPK)和磷脂酶C-γ(PLC-γ)信號通路，促進軸突生長和調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性。

總之，本實驗結(jié)果表明神經(jīng)電刺激能促進NGF和nestin的表達，可能促進神經(jīng)存活和神經(jīng)可塑性，從而在大鼠后肢運動功能中起重要作用。