武月玲，曲海霞，王俊星

(運城市中心醫(yī)院/山西醫(yī)科大學(xué) 第八臨床醫(yī)學(xué)院 麻醉科， 山西 運城 044000)

缺血-再灌注(ischaemia-reperfusion，I/R)可導(dǎo)致機體多種損傷。右美托咪啶(dexmedetomidine，DEX)可通過增高線粒體膜電位(△ψm)，減輕I/R導(dǎo)致的線粒體損傷[1-2]。去乙酰化酶3(sirtuin3，SIRT3)主要位于線粒體，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙?；竅3]，其可通過脫乙?；€粒體基質(zhì)中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2，SOD2)及親環(huán)素D(cycolphilin D，Cyp D)發(fā)揮線粒體保護作用[4-5]。SIRT3過表達可通過恢復(fù)線粒體動力學(xué)緩解I/R引起的包括急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)在內(nèi)的多種損傷[6-7]，表明在I/R中DEX與SIRT3具有重要關(guān)系。但DEX是否通過上調(diào)SIRT3緩解I/R引起的AKI尚不清楚。本研究觀察腎I/R時DEX是否通過上調(diào)SIRT3發(fā)揮對腎的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性C57 BL/6J小鼠50只，8周齡，23.5～26.5 g(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK2019-0004)飼養(yǎng)于相對濕度45%～55%、晝夜循環(huán)12 h的SPF級動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2 試劑：抗SIRT3及acetylated lysine抗體(Santa Cruz公司)；抗Cyt C抗體(Abcam公司)；抗Cyp D抗體(Cell Signaling Technology公司)；Protein G magnetic beads(Millipore公司)；Tunel試劑盒和HE試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；SIRT3活性檢測試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒-SIRT3 siRNA的構(gòu)建：慢病毒攜帶的SIRT3 siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計、鑒定并擴增。方法步驟簡述，小鼠SIRT3(Gene ID: 64384)siRNA序列(5′-GCGTTGTGAAACCCGACAT-3′)，并將其克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1α-GFP-puro慢病毒載體中，經(jīng)酶切及基因測序鑒定，將陽性表達載體共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞，收集上清液，并進行病毒滴度測定。

1.2.2 小鼠的分組及處理：將小鼠分為假手術(shù)(sham)組、siRNA+sham組、腎缺血-再灌注損傷(I/R)組、DEX+I/R組、siRNA+I/R組及siRNA+DEX+I/R組，每組至少6只小鼠。DEX+I/R組腹腔注射DEX(25 μg/kg)，siRNA+sham組、siRNA+I/R組、siRNA+DEX+I/R組術(shù)前3 d尾靜脈注射5×109TU/mL/kg慢病毒-si-SIRT3。

1.2.3 腎功能的檢測：用奧林巴斯AU2700自動生化分析儀測定小鼠血清肌酐及血漿尿素濃度。

1.2.4 HE染色法檢測腎組織形態(tài)學(xué)：小鼠腎臟組織常規(guī)處理后，再HE染色，顯微鏡觀察。

1.2.5 Tunel染色法檢測腎組織凋亡：小鼠腎臟組織經(jīng)常規(guī)處理后，再Tunel染色，顯微鏡觀察。

1.2.6 SIRT3試劑盒檢測腎組織SIRT3活性：取小鼠腎臟組織，按SIRT3試劑盒說明書檢測腎組織SIRT3活性。

1.2.7 ELISA檢測血清胱抑素C(cystatin C，Cys C)和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的含量：取小鼠尾靜脈血，分離血清，按ELISA試劑盒說明書檢測血清中Cys C和NGAL的水平。

1.2.8 Western blot檢測腎組織SIRT3、Cyp D、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C) 及乙?；疌yp D表達：通過RIPA裂解液取小鼠腎組織全蛋白，BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度。取15 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V 2 h后，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以1∶2 000的稀釋比例孵育Ⅰ抗體(SIRT3、Cyp D及Cyt C)，4 ℃過夜。次日，以TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶10 000稀釋)1 h，以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。乙?；腃yp D檢測采用乙酰賴氨酸殘基抗體包裹蛋白磁珠G 沉淀，95 ℃變性，SDS分離蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，抗體孵育及顯影方法同前。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 右美托咪啶可緩解小鼠腎I/R損傷

與sham組比較，I/R組血清肌酐、NGAL、Cys C及血漿尿素水平均明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX+I/R組上述指標(biāo)均明顯降低(P<0.05)(圖1A～D)。I/R組腎小管擴張，腔內(nèi)充血，上皮細胞呈空泡化且呈管狀壞死；右美托咪啶處理可緩解I/R導(dǎo)致的病理變化(圖1E，F(xiàn))。

2.2 右美托咪啶可減輕I/R導(dǎo)致的腎損傷相關(guān)蛋白異常

與sham組比較，I/R組腎SIRT3水平明顯降低，Cyt C及乙酰化Cyp D水平明顯增高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX+I/R組腎SIRT3水平明顯增高(P<0.05)，Cyt C及乙?；疌yp D水平明顯降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 抑制SIRT3可減輕右美托咪啶緩解I/R腎損傷的作用

與DEX+I/R組比較，siRNA+DEX+I/R組血清肌酐、NGAL、Cys C及血漿尿素水平明顯升高(P<0.05) (圖3A～D)。與sham組比較，I/R組腎組織凋亡細胞數(shù)目明顯增高(P<0.05)；DEX處理后，DEX+I/R組凋亡細胞數(shù)目較I/R組減少(P<0.05)，但在siRNA+DEX+I/R組，凋亡細胞數(shù)目明顯高于DEX+I/R組(P<0.05)(圖3E,F)。

2.4 抑制SIRT3減輕右美托咪啶對緩解腎損傷相關(guān)蛋白的作用

與sham組比較，I/R組腎SIRT3的活性明顯降低(P<0.05)；DEX處理后，DEX+I/R組SIRT3的活性較I/R組明顯增高(P<0.05)，但在siRNA+DEX+I/R組，SIRT3的活性明顯低于DEX+I/R組(P<0.05) (圖4B)，SIRT3的蛋白水平也有相似的結(jié)果(圖4A,C)。與DEX+I/R組比較，siRNA+DEX+I/R組腎Cyt C (圖4A,E) 和乙?；疌yp D (圖 4A,D)水平明顯增高(P<0.05)。

3 討論

外界刺激引起線粒體損傷是AKI的病理基礎(chǔ)，阻止線粒體損傷的發(fā)生可有效緩解AKI[8]。有報道[6-7, 9]，SIRT3可通過抑制線粒體損傷來緩解I/R導(dǎo)致的心肌損傷及腎損傷。因此，本研究在腎I/R損傷模型中探討DEX與SIRT3的關(guān)系。

A.quantification of serum creatinine level; B.quantification of serum NGAL level; C.quantification of serum Cys C level; D.quantification of plasma urea level; E.representative HE staining images of renal tissues in sham, I/R and I/R+ DEX treatment groups (scale bar=100 μm); F.semi-quantification of tubular necrosis in each group; *P<0.05 compared with sham group;#P<0.05 compared with I/R group圖1 右美托咪啶可緩解I/R導(dǎo)致的腎功能損傷及病理改變Fig 1 Dexmedetomidine alleviated renal impairment and pathological changes caused by n=6)

A.representative Western blot images of SIRT3, Cyp D and Cyt C in renal tissues of each group; B.quantification of expression of SIRT3 protein; C.quantification of expression of acetylated Cyp D protein; D.quantification of expression of Cyt C protein; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with I/R group圖2 右美托咪啶可減輕I/R導(dǎo)致的腎損傷相關(guān)蛋白異常Fig 2 Dexmedetomidine alleviated kidney injury associated protein abnormalities caused by I/R n=6)

A.quantification of serum creatinine level; B.quantification of serum NGAL level; C.quantification of serum Cys C level; D.quantification of plasma urea level; E representative Tunel staining images of renal tissues in each groups (scale bar=100 μm); F.semi-quantification of Tunel staining in each group; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with I/R group; △P<0.05 compared with DEX+I/R group圖3 抑制SIRT3可減輕右美托咪啶緩解腎I/R損傷的作用Fig 3 Inhibition of SIRT3 attenuated the improving effect of dexmedetomidine on renal I/R injury n≥6)

A.representative Western blot images of SIRT3, Cyp D, Cyt C and acetylated Cyp D protein expression in renal tissues of each group; B.quantification of SIRT3 activity in renal tissues of each group; C.quantification of SIRT3 protein; D.quantification of acetylated Cyp D protein; E.quantification of Cyt C proteins; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with I/R group; △P<0.05 compared with DEX+I/R WT group圖4 抑制SIRT3可減輕右美托咪啶對緩解腎損傷相關(guān)蛋白的作用Fig 4 Inhibition of SIRT3 attenuated the mitigative effect of dexmedetomidine on kidney injury-related

線粒體基質(zhì)蛋白Cyp D過度乙酰化，導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起Cyt C釋放和caspase激活，最終導(dǎo)致腎損傷[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：I/R可引起腎Cyp D過度乙?；?、Cyt C表達增高和細胞凋亡增加；DEX可改善上述變化，從而緩解腎組織病理學(xué)改變。Cyp D抑制劑環(huán)孢霉素A可緩解由Cyp D過度乙酰化導(dǎo)致的線粒體損傷[11]，與本研究結(jié)果一致。SIRT3作為脫乙酰酶，可通過對Cyp D脫乙?；柚笴yp D與腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運子的結(jié)合，抑制線粒體膜通道的開放，從而改善心肌I/R損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)：在腎I/R損傷模型中，SIRT3活性及蛋白表達水平降低；DEX可上調(diào)SIRT3活性及蛋白表達，改善腎功能；而抑制SIRT3可逆轉(zhuǎn)DEX對Cyp D過度乙?；?、Cyt C表達增高和細胞凋亡的緩解作用。DEX通過上調(diào)SIRT3的活性及蛋白水平來拮抗腎I/R損傷。

綜上所述，DEX通過上調(diào)SIRT3在小鼠腎I/R損傷中起到保護作用。