劉 明，楊臣禮，孟慶鑫

(甘肅省中醫(yī)院 心胸外科， 甘肅 蘭州 730000)

缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜[1]，氧化應(yīng)激在其中起主要作用。有報(bào)道具有抗氧化作用的藥物對(duì)預(yù)防心肌I/R損傷有良好效果，包括白藜蘆醇、茶多酚、人參皂苷、東莨菪堿和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)/過氧化氫酶(catalase，CAT)等活性氧清除酶、黃嘌呤氧化酶抑制劑和低分子化合物維生素C、E及輔酶Q等[2]。紫草素(shikonin)作為天然萘醌類化合物，其分子式為C16H16O5，是紫草的根部提取物，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤和抗感染等作用[3-4]。紫草素可在體外明顯抑制脂質(zhì)過氧化，顯著清除自由基，具有較好的抗氧化作用[5]；還可激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)通路提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力，抑制由高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[6]。關(guān)于紫草素對(duì)I/R損傷的心肌細(xì)胞的作用的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究將擬在體外利用H9c2心肌細(xì)胞建造低氧-復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)損傷模型，探討紫草素對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及其保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與藥物：大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)；紫草素(s7576)(Sigma-Aldrich公司)，純度≥98%(HLPC)，用DMSO配制成80 mmol/L的母液備用，用時(shí)稀釋1 000倍。

1.1.2 材料：H-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]、凋亡檢測(cè)試劑盒和周期檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；總谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；Trizol、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；兔抗caspase-3單克隆抗體、兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗Nrf2單克隆抗體、鼠抗Keap1單克隆抗體和DyLight?594標(biāo)記的熒光二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：參照文獻(xiàn)[7]制備模型。對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；H/R組細(xì)胞在37 ℃下通入100% N2(O2<1%)，培養(yǎng)8 h后，恢復(fù)常規(guī)培養(yǎng)24 h；紫草素組細(xì)胞分別用0.1、1和10 μmol/L的紫草素(母液溶解在DMSO中，DMSO終濃度為0.5%)預(yù)處理24 h，隨后進(jìn)行上述H/R實(shí)驗(yàn)；對(duì)照組和H/R組均加入終濃度為0.5%的DMSO。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：制備1.5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL種植于96孔板中，待貼壁后，每孔加入終濃度為0.1、1、10、20、40和80 μmol/L的紫草素，對(duì)照組加入0.1%的DMSO。分別處理24、48和72 h后，再加入10 μL濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO溶解MTT，于490 nm處在酶標(biāo)儀上檢測(cè)A值，并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率。增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100。

為避免紫草素由于濃度過大或處理時(shí)間過長(zhǎng)造成對(duì)H9c2細(xì)胞毒性過高，本研究選取干預(yù)時(shí)間24 h下的對(duì)H9c2細(xì)胞增殖抑制率<10%的0.1、1和10 μmol/L 3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期：按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期。

1.2.4 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞中活性氧水平：在6孔板各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入以無血清培養(yǎng)基稀釋的濃度為10 μmol/L的DCFH-DA 1.5 mL，37 ℃孵育細(xì)胞20 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，熒光顯微鏡拍照。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)：利用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA定量后，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，-20 ℃保存。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗、ECL發(fā)光液顯色、自動(dòng)曝光儀曝光，對(duì)條帶進(jìn)行拍照分析。

1.2.6 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法、ELISA和微量酶標(biāo)法分別檢測(cè)細(xì)胞中MDA、8-OHdG、GSH含量：在磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中研碎細(xì)胞，離心取上清液，按照試劑盒說明書分別檢測(cè)上清液中MDA、8-OHdG和GSH含量，其中TBA法檢測(cè)MDA、ELISA檢測(cè)8-OHdG、微量酶標(biāo)法檢測(cè)GSH。

1.2.7 qPCR檢測(cè)細(xì)胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(human γ-glutamyl systeine synthetase, γ-GCS)、HO-1和醌氧化還原酶1[NAD(P)H dehydrogenase 1, NQO1]mRNA表達(dá)：Trizol法提取總RNA，無RNA酶水溶解后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，然后按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒步驟進(jìn)行qPCR,物序列信息詳見表1，熒光定量反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95 ℃ 10 min，1循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40循環(huán)數(shù)。用2-△△Ct表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 免疫熒光檢測(cè)紫細(xì)胞中Nrf2進(jìn)核：取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，在6孔板中以1.5×105個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁后，洗滌固定，0.25% Triton×100進(jìn)行透膜，山羊血清封閉，4 ℃孵育一抗過夜(1∶200)，洗滌，室溫孵育二抗2 h(1∶2 000)，洗滌，DAPI室溫孵育15 min，洗滌，抗熒光淬滅劑封片，拍照分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響

紫草素可呈濃度-時(shí)間依賴地抑制H9c2增殖(圖1)。

*P<0.05 compared with 0 μmol/L group圖1 紫草素對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of shikonin on proliferation of H9c2 cells

2.2 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞凋亡周期的影響

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞早晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)；紫草素干預(yù)后，隨紫草素濃度的增加，早晚期細(xì)胞凋亡比例較H/R組逐漸減少，1和10 μmol/L紫草素組細(xì)胞凋亡較H/R組顯著減少(P<0.05)(圖2)。

A.flow detection of apoptosis; B.statistics of apoptosis; C.flow detection of cell cycle; D.statistics of cell cycle;*P<0.05 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with H/R group

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，G2期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05)，S期細(xì)胞比例無顯著變化；紫草素干預(yù)后隨紫草素濃度的增加，G1期細(xì)胞比例較H/R組逐漸減少，G2期和S期細(xì)胞比例逐漸增多，1和10 μmol/L紫草素組G1期和G2期細(xì)胞以及10 μmol/L紫草素組S期細(xì)胞的比例變化明顯(P<0.05)(圖2)。

2.3 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中活性氧水平的影響

對(duì)照組細(xì)胞熒光較弱，H/R組細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)；紫草素干預(yù)后，細(xì)胞中熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性逐漸減弱；與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與H/R細(xì)胞相比，1和10 μmol/L紫草素組細(xì)胞中熒光強(qiáng)度顯著減弱(P<0.05)(圖3)。

2.4 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白含量的影響

與正常對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞Bax和cleaved caspase-3蛋白含量顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著減少(P<0.05)；紫草素干預(yù)后，隨紫草素濃度的增加，細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白含量較H/R組逐漸減少，Bcl-2蛋白含量逐漸增加，1和10 μmol/L紫草素組細(xì)胞中Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白含量和10 μmol/L紫草素組細(xì)胞中Bax蛋白含量較H/R組變化明顯(P<0.05)；caspase-3蛋白含量在各組細(xì)胞中無顯著變化(圖4)。

2.5 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中MDA、8-OHdG和GSH含量的影響

與正常組相比，H/R組細(xì)胞中MDA和8-OHdG含量明顯增加，GSH含量明顯減少；隨紫草素濃度的增加，細(xì)胞中MDA和8-OHdG含量逐漸減少，GSH含量逐漸增加(表2)。

2.6 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中γ-GCS、HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)影響

與正常組相比，H/R組細(xì)胞中γ-GCS、HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)均顯著減少(P<0.05)；紫草素干預(yù)后，隨著紫草素濃度的增加，細(xì)胞中γ-GCS、HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)較H/R組逐漸增加，1和10 μmol/L紫草素組細(xì)胞中γ-GCS、HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)較H/R組變化明顯(P<0.05)(圖5)。

2.7 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中Keap1和Nrf2蛋白含量的影響

與正常組相比，H/R組細(xì)胞中Keap1蛋白含量顯著減少(P<0.05)，Nrf2蛋白含量顯著升高(P<0.05)；紫草素干預(yù)后，隨紫草素濃度的增加，細(xì)胞中Keap1蛋白含量較H/R組逐漸減少，Nrf2蛋白含量逐漸升高，1和10 μmol/L紫草素組細(xì)胞中Keap1和Nrf2蛋白含量較H/R組變化明顯(P<0.05)(圖6)。

A.detection of ROS; B.statistics of A value of fluorescence; *P<0.01 compared with control group;#P<0.05, ##P<0.01 compared with H/R group

A.protein band; B.semi-quantitative statistics of protein bands; *P<0.01 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with H/R group

表2 紫草素對(duì)H9c2細(xì)胞中MDA、8-OHdG、GSH含量的影響Table 2 Effect of shikonin on the contents of MDA, 8-OHdG and GSH in H9c2

*P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with H/R group.

2.8 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中Nrf2蛋白進(jìn)核的影響

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞核中可見有較強(qiáng)的熒光聚集；紫草素干預(yù)后，組隨紫草素濃度的增加，細(xì)胞核中熒光強(qiáng)度較H/R組增強(qiáng)(圖7)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)紫草素可呈濃度依賴的上調(diào)H/R造成的心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)下降，下調(diào)H/R造成的心肌細(xì)胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)上升，進(jìn)而降低H/R造成的心肌細(xì)胞凋亡，這種抑制凋亡的作用在心肌細(xì)胞被證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)缺血的心肌再灌注后啟動(dòng)凋亡程序的原因在于缺血期間細(xì)胞內(nèi)氧自由基的生成增多[8-9]。后者通過攻擊細(xì)胞膜和DNA引起凋亡。MDA和8-OHdG分別作為脂質(zhì)和DNA過氧化的標(biāo)志物，本研究中發(fā)現(xiàn)紫草素可降低心肌細(xì)胞中因H/R引起的活性氧水平、MDA和8-OHdG濃度的升高，提示紫草素可降低活性氧水平，保護(hù)H/R心肌細(xì)胞免受過氧化損傷。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with H/R group圖5 紫草素對(duì)H9c2細(xì)胞中γ-GCS、HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)影響Fig 5 Effect of shikonin on the expression of γ-GCS, HO-1 and NQO1 mRNA in H9c2

A.protein band; B.semi-quantitative statistics of protein bands; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with H/R group

在正常心肌細(xì)胞內(nèi)存在抗氧自由基酶系統(tǒng)?？寡踝杂苫赴–AT、γ-GCS、SOD、HO-1及NQO-1等。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素可提高因H/R損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞中降低的GSH含量以及γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)，提示紫草素可通過改善心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R造成的過氧化損傷。

Nrf2-ARE信號(hào)通路被激活后可誘導(dǎo)HO-1、γ-GCS和NQO1等大量保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抵抗各種刺激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷[10]。在正常狀況下，Keap1與Nrf2相結(jié)合，抑制Nrf2進(jìn)核。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下Keap1與Nrf2解離，Nrf2激活進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞的解毒及抗氧化能力，發(fā)揮保護(hù)作用[11-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)H/R可使心肌細(xì)胞內(nèi)Keap1蛋白含量降低，Nrf2蛋白含量升高，而紫草素可進(jìn)一步使心肌細(xì)胞內(nèi)Keap1蛋白含量降低，Nrf2蛋白含量升高，并促進(jìn)Nrf2蛋白大量進(jìn)入細(xì)胞核。提示紫草素可通過進(jìn)一步激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R造成的過氧化損傷。

圖7 紫草素對(duì)H/R損傷的H9c2細(xì)胞中Nrf2蛋白進(jìn)核的影響Fig 7 Effect of shikonin on Nrf2 protein nucleation in H9c2 cells injured by H/R

綜上紫草素可通過激活Nrf2-ARE信號(hào)通路保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R損傷。但是其是否還可通過其他代謝途徑保護(hù)心肌細(xì)胞免受H/R損傷，尚待進(jìn)一步研究。