蘇江維，余 慧，杜 坤，汪 潔，柳 林，蔡 劍

(鄂州市中心醫(yī)院 皮膚科， 湖北 鄂州 436000)

病理瘢痕成纖維細(xì)胞(fibroblast from patholog-ical scars,PSF)是由于皮膚過度愈合造成的，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致正常組織功能結(jié)構(gòu)異常[1]。成纖維細(xì)胞過度增殖是病理性瘢痕形成的主要原因，研究PSF增殖和凋亡機(jī)制具有重要意義[2]。Notch1是Notch信號(hào)通路的主要受體，在多種組織器官發(fā)育中具有重要作用，它可促進(jìn)心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖[3-5]。Notch1在瘢痕組織中過表達(dá)，可能參與瘢痕成纖維細(xì)胞過度增殖過程[6-7]。本文探討下調(diào)Notch1對(duì)PSF增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

增生病理瘢痕組織(鄂州市中心醫(yī)院)，男女各5例，年齡9～32歲，標(biāo)本采集均經(jīng)患者及家屬同意并簽署知情同意書，該研究經(jīng)過鄂州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：EZLY2017-06-24號(hào))。Notch1抗體(MitoSciences公司)；陰性對(duì)照慢病毒和Notch1 siRNA慢病毒(廣州輝駿生物科技有限公司)；活化的caspase-3(c-caspase-3)抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體(天津賽爾生物技術(shù)有限公司)；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)抗體、活化的caspase-9(c-caspase-9)抗體(GeneTex公司)；線粒體蛋白提取試劑盒(Ambion公司)；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；細(xì)胞色素C(cytochrome C)抗體(Proteintech公司)；PCR試劑(Thermo Fisher Scientificals公司)。

1.2 方法

1.2.1 PSFs的分離培養(yǎng)和分組處理:PSFs的分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[14]，將PSFs分為對(duì)照組(control)、siRNA-NC和Notch1 siRNA組。siRNA-NC和Notch1 siRNA為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒和Notch1 siRNA慢病毒的PSFs(感效率高于90%，慢病毒感染復(fù)數(shù)為20，慢病毒感染時(shí)添加Polybrene以增加慢病毒感染效率)。對(duì)照組為不感染慢病毒的PSFs。參照1.3和1.4中方法檢測(cè)干擾效果。Notch1 siRNA序列：正義鏈 5′-GUCCGGAAACAA CUGCAATT-3′，反義鏈 5′-UUGCAGUUGUUUCCUGG ACTT-3′；陰性對(duì)照序列：正義鏈 5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′，反義鏈 5′-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3′。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)Notch1 mRNA：常規(guī)方法提取總RNA，RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，包括：0.5 μg RNA，2 μL mix，7.5 μL無RNase水。用Notch1和內(nèi)參β-actin引物進(jìn)行SYBR定量PCR，20 μL PCR體系，包含0.5 μL的上下游引物，10 μL的2×ultra SYBR mixture，1 μL的cDNA，8 μL的RNase-free水。引物為：Notch1上游引物：5′-GGCAACAGCGAGGAAGAGGA-3′，下游引物：5′-CAGAAACAGGGGTGTCTCCT-3′。β-actin上游引物5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′。Real-time PCR程序設(shè)置：變性(94 ℃ 15 s)；退火(60 ℃ 15 s)；延伸(72 ℃ 20 s)；熒光檢測(cè)(76 ℃ 3 s)，溶解曲線75 ℃～95 ℃。結(jié)果以2-△△Ct表示。

1.2.3 Western blot檢測(cè)Notch1、cyclin D1、CDK4、c-caspase-3和c-caspase-9表達(dá):加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞、PBS漂洗及800×g離心10 min。按照106個(gè)細(xì)胞中加入500 μL的裂解液將細(xì)胞裂解后，12 000×g離心10 min，取各組離心上清液，置于-20 ℃保存。BCA法定量蛋白，SDS-PAGE蛋白上樣量為40 μg，電壓設(shè)置為90 V。轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為90 V，轉(zhuǎn)膜在冰上操作，轉(zhuǎn)膜2 h。封閉：電轉(zhuǎn)后的NC膜放在5%脫脂奶粉孵育液中，室溫緩慢搖晃結(jié)合60 min。蛋白印跡：添加TBST把NC膜反復(fù)洗滌3次，將NC膜置于1∶500稀釋的Notch1抗體結(jié)合液中，cyclin D1、CDK4、c-caspase-3和c-caspase-9抗體以1∶800、40和1∶400稀釋，置于4 ℃冰箱反應(yīng)過夜，經(jīng)TBST洗膜，與1∶1 000稀釋的二抗在室溫條件中反應(yīng)2 h，TBST洗膜，用ECL顯色試劑盒顯色，掃描圖像，分析目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶的A值。按照公式：目的蛋白水平=目的蛋白條帶A值÷β-actinA值計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：在每個(gè)96孔板內(nèi)加入4×103個(gè)細(xì)胞，以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，分析各組細(xì)胞存活率水平。

1.2.5 檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡:用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布。用annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用結(jié)合緩沖液500 μL將各組細(xì)胞懸浮以后，分別加入5 μL的annexin V-FITC和5 μL的PI，混合以后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.2.6 檢測(cè)線粒體膜電位和cytochrome C蛋白水平：用JC-1法線粒體膜電位試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位，結(jié)果用紅色熒光和綠色熒光的比值表示。線粒體和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取線粒體和胞質(zhì)中蛋白，用Western blot檢測(cè)cytochrome C蛋白表達(dá)，步驟同1.4，蛋白提取步驟同線粒體和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒。線粒體內(nèi)蛋白內(nèi)參為VDAC1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Notch1 siRNA降低PSFs中Notch1表達(dá)水平

Notch1 siRNA慢病毒感染后的PSFs中Notch1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)(圖1)。

A.Notch1 mRNA level; B.Notch1 protein expression band; C.Notch1 protein level；*P<0.05 compared with control and siRNA-NC圖1 Notch1 siRNA慢病毒感染后的PSFs中Notch1 表達(dá)差異Fig 1 Differences in Notch1 expression in PSFs infected with Notch1 siRNA

2.2 下調(diào)Notch1抑制PSFs增殖

下調(diào)Notch1的PSFs存活率降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control and siRNA-NC圖2 下調(diào)Notch1對(duì)PSFs存活率的影響Fig 2 Effect of down-regulation of Notch1 on PSFs

2.3 下調(diào)Notch1阻礙PSFs周期進(jìn)展

下調(diào)Notch1的PSF G0/G1期比例明顯升高(P<0.05)，cyclin D1和CDK4蛋白水平降低(P<0.05)(圖3)。

A.PSFs cell cycle changes; B.cyclin D1 and CDK4 protein expression bands; C.cyclin D1 and CDK4 protein levels;*P<0.05 compared with control and siRNA-NC

2.4 下調(diào)Notch1誘導(dǎo)PSFs凋亡

下調(diào)Notch1的PSFs凋亡率明顯升高(P<0.05)，表明下調(diào)Notch1誘導(dǎo)PSF凋亡(圖4,表1)。

圖4 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)PSFs凋亡Fig 4 Flow cytometry detecting apoptosis of PSFs

表1 下調(diào)Notch1對(duì)PSF凋亡的影響Table 1 Effect of down-regulation of Notch1 on PSF

*P<0.05 compared with control and siRNA-NC.

2.5 下調(diào)Notch1對(duì)PSFs中c-caspase-3、c-caspase-9、caspase-3 和caspase-9 蛋白水平影響

下調(diào)Notch1的PSFs中c-caspase-3、c-caspase-9蛋白水平升高(P<0.05)(圖5,表2)。

圖5 下調(diào)Notch1后PSF中c-caspase-3、c-caspase-9、caspase-3 和caspase-9蛋白表達(dá)Fig 5 Protein expression of c-caspase-3, c-caspase-9, caspase-3 and caspase-9 in PSF after down- regulation of Notch1

表2 下調(diào)Notch1對(duì)PSF中c-caspase-3、c-caspase-9、caspase-3 和caspase-9 蛋白水平的影響Table 2 Effect of down-regulation of Notch1 on the levels of c-caspase-3, c-caspase-9, caspase-3 and caspase-9 in

*P<0.05compared with control and siRNA-NC.

2.6 下調(diào)Notch1降低線粒體膜電位并減少線粒體釋放cytochrome C

下調(diào)Notch1的PSF線粒體cytochrome C蛋白減少而胞質(zhì)cytochrome C蛋白水平升高(P<0.05)，細(xì)胞線粒體膜電位下降(P<0.05)(圖6,表3)。

A.level of cytochrome C protein in mitochondria; B.level of cytochrome C protein in the cytoplasm圖6 下調(diào)Notch1后PSFs中cytochrome C蛋白水平變化Fig 6 Protein levels of cytochrome C in mitochondria and cytoplasm of PSFs after down-regulation of Notch1

表3 下調(diào)Notch1對(duì)PSF線粒體和胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平影響Table 3 Effect of down-regulation of Notch1 on the levels of cytochrome C protein in mitochondria and

*P<0.05 compared with control and siRNA-NC.

3 討論

細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期的兩大家族，CDK4是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶家族成員，cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白家族成員。

CDK4和cyclin D1在G1期表達(dá)升高，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變[8-10]。下調(diào)Notch1可以抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，并將細(xì)胞周期阻滯在G1期[11-12]。本實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)Notch1后的PSFs G0/G1期比例升高，細(xì)胞中CDK4和cyclin D1蛋白水平降低，提示下調(diào)Notch1可以通過抑制CDK4和cyclin D1蛋白表達(dá)阻礙細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變。

細(xì)胞凋亡和增殖是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的前提，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以被胞質(zhì)中的cytochrome C激活[13]。正常情況下，線粒體內(nèi)外存在一定的滲透壓，cytochrome C進(jìn)入到胞質(zhì)以后可以激活caspase-9及caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。Notch1可提高心肌細(xì)胞線粒體膜電位，減少心肌細(xì)胞凋亡，是線粒體膜電位的正調(diào)控因子[15]。下調(diào)Notch1后的PSF中活化的caspase-9和caspase-3明顯升高，胞質(zhì)內(nèi)的cytochrome C蛋白含量增多，線粒體膜電位明顯下調(diào)，說明下調(diào)Notch1能夠通過降低線粒體膜電位促進(jìn)caspase凋亡反應(yīng)發(fā)生。

綜上，下調(diào)Notch1可阻礙PSF周期進(jìn)展，抑制其增殖，降低線粒體膜電位誘導(dǎo)caspase凋亡反應(yīng)促進(jìn)PSF凋亡。下調(diào)Notch1可能是抑制PSF增生的潛在途徑，為病理性瘢痕的治療提供了新思路。