劉盼盼,張子銳,楊 旭,韓 晶,陸連芳,王愛(ài)敏,張 菊*
(1.青島大學(xué) 護(hù)理學(xué)院 山東 青島 266000; 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科, 山東 青島 266000)
壓力性損傷(pressure injury, PI),又名壓力性潰瘍或褥瘡,據(jù)統(tǒng)計(jì),在中國(guó)綜合性醫(yī)院壓力性損傷發(fā)生率為3% ~ 14%[1]。其中深部組織壓力性損傷(deep tissue pressure injury, DTPI)由于其病情隱匿、發(fā)展迅速以及治療成本高等特點(diǎn)引起臨床傷口專(zhuān)家們的高度重視。其常見(jiàn)于移動(dòng)能力受限患者的骨突強(qiáng)烈或長(zhǎng)期受力部位,主要因局部組織缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)引起血管內(nèi)皮損傷并啟動(dòng)炎性反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致微循環(huán)障礙、毛細(xì)血管網(wǎng)密度減少[2]。因此,選擇有效的藥物治療深部組織壓力性損傷,已成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
姜黃素(curcumin,Cur)是一種從中藥材姜黃中提取的植物多酚,也是姜黃最主要的活性成分[3]。研究表明,姜黃素能夠減輕小鼠糖尿病足潰瘍損傷,提示姜黃素可能對(duì)慢性傷口損傷有一定的保護(hù)作用,但其能否減輕缺血-再灌注導(dǎo)致的深部組織壓力性損傷尚有待研究[4-5]。基于此,本實(shí)驗(yàn)擬評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)缺血-再灌注導(dǎo)致的小鼠深部組織壓力性損傷的影響,初步探討其分子作用機(jī)制,為臨床治療提供理論依據(jù)。
1.1.1 藥品與試劑:姜黃素(Sigma-Aldrich公司);IL-6、IL-10、VEGF-α、TGF-β和TNF-α引物(青島德羅海達(dá)生物技術(shù)有限公司合成);Stat3、p-Stat3、VEGF-α和TGF-β單克隆抗體(萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司);其他有機(jī)分析純?cè)噭?青島德瑞康生物科技有限公司)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)8 ~ 10周齡雄性C57BL/6小鼠30只,體質(zhì)量20 ~ 22 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)合格證:SCXK京2016-0006)。
1.2.1 小鼠的分組及處理:按照以往文獻(xiàn)報(bào)道的方法建立小鼠深部組織壓力性損傷模型[6]。腹腔注射4%水合氯醛7.5 mL/kg麻醉小鼠后,用剃毛器除去背部被毛,選擇小鼠坐骨棘突附近皮膚組織施壓,在施壓處上下兩側(cè)各放置一塊相同磁鐵(直徑12 mm,厚5 mm,重2.4 g,表面磁通量為1 000高斯)。施壓12 h后釋放12 h為1個(gè)循環(huán),共1個(gè)循環(huán)。施壓期間小鼠正常進(jìn)食、活動(dòng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為模型組(Mod)、姜黃素4 mg/kg組(Cur 4)、姜黃素8 mg/kg組(Cur 8),每組10只。另取10只正常小鼠作為對(duì)照組 (Con)。以模型構(gòu)建成功為第0天,于1、3、5、7、9、11和13天,平均每只小鼠體質(zhì)量按20 g計(jì)算,Cur 4組的每只小鼠創(chuàng)面皮下注射0.8 g/L姜黃素0.1 mL,Cur 8組的每只小鼠創(chuàng)面皮下注射1.6 g/L姜黃素0.1 mL。對(duì)照組和模型組小鼠不做任何處理。
1.2.2 傷口愈合狀況測(cè)定:建模后第1、3、5、7、10、12和14天在相同條件下于小鼠局部創(chuàng)面拍照,使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)傷口面積。以第3天傷口面積為基準(zhǔn),傷口愈合百分比=未愈合傷口面積/第3天傷口面積。
1.2.3 HE染色:于第14天頸椎脫臼法處死小鼠,取創(chuàng)面及周?chē)? cm皮膚組織,固定于4%多聚甲醛,制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察。
1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá):Trizol法提取傷口組織總mRNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA。Q-PCR檢測(cè)借助熒光定量PCR試劑盒,設(shè)置程序:95 ℃ 15 min; 95 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,40次循環(huán);擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)制作。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表1。
1.2.5 Western blot檢測(cè)目的蛋白:取凍存的皮膚肌肉組織樣本,勻漿化后向裂解液內(nèi)加入等體積含十二烷基硫酸鈉的蛋白緩沖液,水浴鍋內(nèi)煮沸10 min,4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后收集上清液。采用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定樣本內(nèi)蛋白濃度,用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。常溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h,經(jīng)TBST溶液清洗2次后加入適度稀釋的第一抗體(VEGF-α、TGF-β、Stat3、p-Stat3、β-actin),4 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體孵育1 h,最后加入底物并曝光、顯影。
表1 引物序列Table 1 Sequence of the primers
3組小鼠建模后第1天,創(chuàng)面呈蒼白色圓形,創(chuàng)周清晰整齊。深部組織壓力性損傷第3天,3組創(chuàng)面邊緣逐漸模糊,顏色加深。第5天,3組創(chuàng)面均擴(kuò)大、不同程度凹陷,顏色進(jìn)一步加深呈黃褐色。第7天,模型組創(chuàng)面進(jìn)一步惡化發(fā)展,而干預(yù)組創(chuàng)面出現(xiàn)縮小態(tài)勢(shì)。第10天,模型組創(chuàng)面縮小但是顏色加深呈深褐色,Cur 8組傷口面積明顯縮小,創(chuàng)緣處可見(jiàn)結(jié)痂。第12~14天,模型組創(chuàng)面緩慢縮小,部分結(jié)痂覆蓋;Cur 8組創(chuàng)面完全結(jié)痂覆蓋,且見(jiàn)結(jié)痂與創(chuàng)緣分離,周?chē)凵律掀じ采w明顯。3組小鼠的創(chuàng)面愈合宏觀情況見(jiàn)圖1。
圖1 小鼠DTPI的創(chuàng)面愈合情況Fig 1 Wound healing of DTPI in mice
以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合的依據(jù),不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合比(表2)。深部組織壓力性損傷后第7、10、12和14天,Cur 8組小鼠創(chuàng)面愈合比均分別顯著低于模型組(P<0.05);Cur 4組只在第7、10天創(chuàng)面愈合比低于模型組(P<0.05),其第14天創(chuàng)面愈合比與模型組無(wú)顯著差別。
表2 姜黃素對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合比的影響Table 2 Effect of curcumin on wound healing ratio in n=3)
*P<0.05 compared with model group.
實(shí)驗(yàn)第14 天,組織切片染色結(jié)果(圖2)。相比對(duì)照組,模型組創(chuàng)面肉芽組織較少,可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及毛細(xì)血管。相比模型組,Cur 8組肉芽組織更為豐富,可見(jiàn)較多的成纖維細(xì)胞、膠原纖維及新生毛細(xì)血管。Cur 4組病理改變介于模型組與Cur 8組之間。
*P<0.05 compared with model group圖2 DTPI后第14天的組織形態(tài)學(xué)觀察Fig 2 Histological examination at day 14 after DTPI(HE staining×100)
深部組織壓力性損傷第14天,與對(duì)照組相比,模型組TGF-β、IL-10和VEGF-α的mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05),IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)顯著增多(P<0.05)。Cur 4和Cur 8組創(chuàng)面組織中IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05);而Cur 8組創(chuàng)面組織中VEGF-α、IL-10和TGF-β含量明顯高于模型組(P<0.05)(圖3)。
*P<0.05 compared with model group圖3 小鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF-α、TGF-β mRNA表達(dá)Fig 3 mRNA expression of TNF-α, IL-6, IL-10, VEGF-α, TGF-β and HIF-1α in the wound n=3)
與對(duì)照組相比,模型組VEGF-α、TGF-β和p-Stat3蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。Cur 8組VEGF-α、TGF-β和p-Stat3蛋白較模型組明顯升高(P<0.05),Cur 4組TGF-β和p-Stat3蛋白較模型組表達(dá)增加(P<0.05),而3組實(shí)驗(yàn)中Stat3蛋白含量無(wú)明顯區(qū)別(圖4)。
*P<0.05 compared with model group圖4 DTPI中p-Stat3、Stat3、 TGF-β 和 VEGF-α的蛋白表達(dá)Fig 4 Expression of p-Stat3, Stat3, TGF-β and VEGF-α in the DTPI in n=3)
姜黃素具有抗感染、抗氧化、抗癌等多種藥理作用,臨床上常用于治療鼻炎、呼吸道疾病和腸道疾病等[7],其對(duì)改善缺血-再灌注引起的腎損傷、腦損傷及炎性反應(yīng)等有很好的療效[8],但姜黃素在缺血-再灌注引起的深部組織壓力性損傷中的保護(hù)作用及分子機(jī)制仍不明確。
深部組織壓力性損傷是由于骨突部位持續(xù)的機(jī)械力導(dǎo)致的多層組織壞死,持續(xù)的炎性反應(yīng)和血管密度驟減是其難以愈合的關(guān)鍵因素[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中局部注射姜黃素后, 創(chuàng)面愈合率優(yōu)于未處理模型組。HE結(jié)果表明,相比模型組,Cur 8組出現(xiàn)更多的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)、新生血管和血管壁增厚現(xiàn)象。與模型組相比,Cur 8組中IL-6和TNF-α的表達(dá)量顯著降低,而IL-10的表達(dá)量顯著增加。尤其,姜黃素可使深部組織壓力性損傷后組織中VEGF-α和TGF-β的表達(dá)量增加,該研究結(jié)果與報(bào)道一致[11]。IL-6和TNF-α是參與機(jī)體炎性反應(yīng)的重要炎性介質(zhì),且TNF-α可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡,抑制膠原沉積,阻礙傷口愈合;而IL-10是一種存在于缺血組織中的抗炎細(xì)胞因子,能刺激創(chuàng)面肉芽組織形成,是組織修復(fù)中的重要細(xì)胞因子之一。說(shuō)明姜黃素可以減輕深部組織壓力性損傷中的炎性反應(yīng)。
同時(shí),本研究初步探索了姜黃素在深部組織壓力性損傷中的分子作用機(jī)制。JAK-STAT信號(hào)通路在機(jī)體的應(yīng)激與炎性反應(yīng)及創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[12]。STATs對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)的傳遞具有特異性, STAT3活化后成為p-STAT3, 能誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡及血管生成等生物學(xué)行為相關(guān)的下游靶基因的表達(dá), 且VEGF啟動(dòng)子上存有STAT3的結(jié)合位點(diǎn)序列[13]。Cur 8組p-STAT3、VEGF-α表達(dá)較模型組明顯增加,可見(jiàn)姜黃素激活STAT3進(jìn)而誘導(dǎo)VEGF-α的表達(dá),VEGF作為一種高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂源,進(jìn)一步誘導(dǎo)新生血管形成,促進(jìn)肉芽組織生成,從而加快創(chuàng)面愈合,實(shí)現(xiàn)促進(jìn)小鼠深部組織壓力性損傷血管新生的作用。
綜上所述,8 mg/kg 姜黃素對(duì)于保護(hù)小鼠深部組織壓力性損傷效果顯著,且組織炎性反應(yīng)抑制及血管再生促進(jìn)可能與姜黃素激活JAK-STAT信號(hào)通路直接相關(guān)。但姜黃素是否通過(guò)直接靶向作用于STAT3,姜黃素的治療劑量以及在臨床中是否具有同樣治療效果還有待后期進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。