孫金輝 潘 霞 徐永健 顏 鑫 謝尚端

(1. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211)

重金屬是常見的海洋污染物, 主要由人類生產(chǎn)生活產(chǎn)生并被攜帶至海中[1,2]。由于重金屬的毒性、持久性以及生物累積的特性, 會對人類、生物和自然生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成嚴重威脅[3,4]。如銅能影響生物體內(nèi)的酶系統(tǒng)[5], 會導(dǎo)致生理受阻, 發(fā)育停滯[6],急性銅中毒會刺激胃腸道黏膜, 慢性中毒則會引起肝硬化[7]; 鎘為“五毒之首”, 有致畸、致癌特性, 鎘污染會使動物酶系統(tǒng)受到抑制[8,9], 長期受鎘影響會損傷腎、肺、肝[10]等, 會使卵母細胞成活率、受精率降低, 最終導(dǎo)致不孕不育[11]。

海洋青鳉(Oryzias melastigma)是一種新興的海水模式生物, 對水質(zhì)和環(huán)境變化極敏感, 是毒理學(xué)上至關(guān)重要的監(jiān)測物種[12,13]。相比斑馬魚(Barchydanio rerio)和日本青鳉(Oryzias latipes), 其在培養(yǎng)條件、生理、行為及分子信息等方面具有明顯優(yōu)勢[14,15], 是海洋環(huán)境毒理學(xué)上有應(yīng)用潛力的重要生物監(jiān)測種類[16—18], 已被國際生命科學(xué)學(xué)會(ILSI)認定為毒理學(xué)研究的重要模式生物[19], 也是國際標準組織(ISO)推薦的毒性實驗標準用魚之一[20]。研究海洋青鳉能夠擴充海洋生態(tài)毒理模式的生物領(lǐng)域, 豐富不同污染條件下海洋青鳉的反應(yīng)情況, 為日后海洋污染生態(tài)學(xué)和模式生物的研究發(fā)展打好基礎(chǔ)[21]。

利用日本青鳉監(jiān)測淡水水質(zhì)的相關(guān)方法已較為成熟, 通過識別魚的行為判斷水質(zhì)是否發(fā)生變化[22,23]。應(yīng)用該方法所建立的純生物傳感技術(shù), 現(xiàn)已能精確地判斷水質(zhì)的污染狀態(tài), 并可根據(jù)行為差異進行污染程度劃分[23]。而利用海洋青鳉進行海水水質(zhì)監(jiān)測的相關(guān)方法和技術(shù)較日本青鳉比還有很大的差距, 目前涉及海洋青鳉的研究, 主要以幼魚較多[24], 成魚較少; 高濃度重金屬脅迫較多, 低濃度脅迫較少。

本文以海洋青鳉成魚作為實驗生物, 分析不同濃度銅、鎘脅迫下魚體的一些生理生化指標變化,以乳酸(LA)含量、乳酸脫氫酶(LDH)活性來反應(yīng)脅迫對魚體體能消耗的影響[25], 以睪酮(T)、促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)含量和產(chǎn)卵量來反應(yīng)脅迫對魚體生殖能力的影響。把環(huán)境脅迫-能量消耗-生殖能力下降等現(xiàn)象聯(lián)系起來, 反映一些化學(xué)監(jiān)測、物理監(jiān)測甚至常規(guī)生物監(jiān)測都難以發(fā)現(xiàn)的低濃度毒物對生物有機體的慢性和深度影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

海洋青鳉魚卵由廈門大學(xué)王克堅老師實驗室惠贈, 已于本實驗室成功擴繁五代以上。擴繁條件： 水溫： 28—30℃, 鹽度： 28—30, 光照： 8000 lx, 光照周期： L14h∶D10h, 餌料： 新孵化鹵蟲幼體。試驗用的青鳉成魚為4—5月齡, 是正常繁殖群體。雄魚體全長為(4.0±0.25) cm、體重(0.52±0.13) g, 雌魚體全長為(3.5±0.19) cm、體重(0.45±0.11) g。

1.2 實驗設(shè)計

以海水水質(zhì)標準為參考, 依據(jù)文獻[26]報道設(shè)置銅和鎘的濃度梯度。銅(CuSO4·5H2O(AR)配制)設(shè)3個梯度： C1： 1/10的96hLC50(0.017 mg/L), C2：1/2的96hLC50(0.087 mg/L), C3： 96hLC50(0.174 mg/L); 鎘[CdCl2·2.5H2O (AR)]3個梯度： G1： 1/10的96hLC50(0.650 mg/L), G2： 1/2的96hLC50(3.249 mg/L), G3： 96hLC50(6.497 mg/L)。每個處理3個重復(fù),并設(shè)置一個空白組作對照(C0/G0)。每組放養(yǎng)青鳉成魚20尾(雌雄各半), 養(yǎng)殖水體30 L, 養(yǎng)殖海水用自來水+海水晶(廣州益爾生物工程有限公司)配制, 條件同擴繁條件。每日清理養(yǎng)殖缸中的排泄物并更換約20%同濃度現(xiàn)配海水。分別于4d和15d, 在吸污換水時收集沉底的卵, 計數(shù)后統(tǒng)計各處理的產(chǎn)卵情況, 計算單尾雌魚的平均產(chǎn)卵量(粒)。

試驗共持續(xù)15d(28℃時青鳉一個繁殖周期)。分別于4d和15d取樣, 測定LA、LDH、T、FSH和LH。每次從每組中隨機撈取雌雄各3尾魚, 用蒸餾水沖洗2—3遍, 加入5 mL 0.9%生理鹽水并勻漿,3000×g低溫(4℃)離心10min后取上清, 然后根據(jù)檢測試劑盒(購于上海源葉生物技術(shù)有限公司)說明書的操作步驟測定LA、LDH、T、LH和FSH等指標。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

實驗結(jié)果利用Microsoft Excel和SAS 8.01 軟件進行統(tǒng)計分析, 采用單因素方差分析(ANOVA), 并選取Duncan法對實驗組進行比較,P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 銅或鎘脅迫對海洋青鳉成魚中LA含量的影響

如圖1所示, 在試驗過程中, 對照組前后LA含量無顯著性差異, 雌雄個體間也無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 不同濃度銅或鎘脅迫下海洋青鳉的乳酸(LA)含量變化Fig. 1 The lactic acid contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

銅脅迫4d, 不同濃度處理組的LA含量出現(xiàn)了較大變化, 總體上隨銅濃度升高而LA含量下降, 與C0相比, C1顯著上升、C2持平、C3顯著下降;C1上升主要是雌魚的LA大幅升高所致, 該濃度對雄魚影響不大; C2銅濃度對雌魚和雄魚有相反的影響, 兩者平均后與對照無差異; C3銅濃度對兩性都有影響, 雌魚影響類似于C2, 而雄魚的LA含量非常低, 僅為14.4 mmol/L, 遠低于對照及其他處理。至15d, 魚體中的LA含量仍然是隨著銅濃度的升高而顯著下降。所有處理都低于對照組, 其中, C1的雌魚近似對照, 雄魚有較低值; C2兩者都低于C1和對照, 雄魚大大低于雌魚; C3類似于C2, 其中雄魚與C2相近, 雌魚低于C2, 因此整體不如C2 (P＜0.05)。

鎘脅迫4d, 不同濃度處理青鳉魚體內(nèi)的LA變化與銅脅迫時有所不同。整體上, LA含量隨鎘濃度的升高而升高, 隨脅迫時間的延長而下降。G1處理僅比G0略低, G2高于G0, G3最高, 兩兩組間差異顯著(P＜0.05)。對性別的影響, 雄性的LA含量都低于雌性, 差異顯著(P＜0.05), 此外G1與G2中雄魚的LA相似, 并低于G3。至15d, 各處理的LA含量進一步下降, 脅迫組的LA含量都比對照組低(P＜0.05)。對性別的影響, 除G1外其余處理中雄魚要低于雌魚(圖1)。

2.2 銅或鎘脅迫對海洋青鳉成魚中LDH活性的影響

在實驗過程中, 對照組青鳉體內(nèi)的LDH活性無顯著性差異(P＞0.05)。銅脅迫4d, C2低于對照, 而C1與C3組高于對照, 后兩者間差異不顯著; 其中,C1雌魚的LDH活性較雄魚強, C2相似, 而C3則相反, 雄魚的LDH活性強于雌魚。至15d, 各處理的LDH活性進一步下降, C1處理主要是雄魚的下降造成, C2是雌魚下降明顯, 而C3兩性同時都下降。

鎘脅迫4d (圖2), 與對照比較, G1和G3的LDH活性略有下降, G2下降最多。其中, G1和G2處理, 鎘對雌雄魚的影響相近, 而G3中雄魚LDH活性下降更顯著。至15d, 各處理的LDH活性都有較大的升高。G1升高最為明顯, 雌魚比雄魚升高更多;G2恢復(fù)到與對照相似水平, G3比對照稍高一點(P＜0.05)。

圖2 不同濃度銅或鎘脅迫下海洋青鳉體內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)活性的變化Fig. 2 Lactate dehydrogenase activities of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

2.3 銅或鎘脅迫對海洋青鳉成魚中T含量的影響

在試驗過程中, 對照組前后魚體中的T含量無顯著性差異(P＞0.05)。銅脅迫4d, 各處理的T含量都有所上升, 升幅相近。其中C1中雌魚較雄魚上升多, 而C2和C3卻相反。至15d, 各處理的T含量都下降, 其中C3下降最為明顯。兩性間的差異類似于第4天, 其中比較特別的是C2處理, 雄魚保持著高于對照水平的T含量, 但雌魚下降很大; C3兩性都下降,也是雌魚下降更大。

在鎘脅迫時, T含量隨鎘濃度的升高而升高, 其中G1與對照相近, G2和G3高于對照(P＜0.05)。脅迫4d時, 3個處理雌魚的T含量都升高了, 且升幅大于雄魚。至15d, G1處理與對照相近, G2和G3處理都高于對照, 雄魚的含量高于雌魚(圖3)。

2.4 銅或鎘脅迫對海洋青鳉成魚中FSH含量的影響

在試驗期間, 對照處理中魚體的FSH含量前后也無顯著性差異(P＞0.05)。銅脅迫4d, 僅C2略低于對照, C1和C3與對照無差異。對性別的影響, 也僅C3, 雌魚略有上升, 而雄魚略有下降。至15d, C1比第4天略有下降, 但C2和C3的FSH都有大的降幅,C3的降幅最大, 與C2間有差異(P＜0.05)。各組中兩性間的差異不大。鎘脅迫4d, 3個處理中FSH都略有下降, 其中G2降幅最大。在所有處理中, 雄魚的降幅都大于雌魚。至15d, 各處理中FSH含量都上升了。其中, G1和G3已接近于對照, 而G2略低于對照。雌雄間基本無差別(圖4)。

2.5 銅或鎘脅迫對海洋青鳉成魚中LH含量的影響

在試驗期間, 對照組中魚體的LH含量前后無顯著性差異(P＞0.05, 圖5)。銅脅迫4d, 各組與對照相似, 性別間也無差異。至15d, 各組的LH含量都降低了, 且隨銅濃度升高而下降越明顯(P＜0.05), 但性別間仍無差異。鎘脅迫4d, G1略有下降, G2降幅較大, 而G3與對照相似。所有處理雄魚的降幅都大于雌魚。至15d, 各處理中LH含量都有所恢復(fù)。G1和G3 都接近于對照, 而G2略低于對照。

圖3 不同濃度銅或鎘脅迫下海洋青鳉魚體內(nèi)睪酮(T)含量的變化Fig. 3 Testosterone contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

圖4 不同濃度銅或鎘脅迫下海洋青鳉體內(nèi)促卵泡素(FSH)含量的變化Fig. 4 Follicle stimulating hormone contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

圖5 不同濃度銅或鎘脅迫下海洋青鳉體內(nèi)促黃體生成素(LH)含量的變化Fig. 5 Luteinizing hormone contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

2.6 銅或鎘脅迫對海洋青鳉成魚產(chǎn)卵量的影響

在試驗過程中, 所有處理都未出現(xiàn)海洋青鳉死亡現(xiàn)象。短時間(4d)的銅脅迫對產(chǎn)卵量基本沒有影響, 但隨著脅迫時間的延長(15d)和脅迫濃度的升高, 海洋青鳉產(chǎn)卵量下降非常明顯(圖6)。而短時(4d)的鎘脅迫, 僅高濃度(G2)處理的產(chǎn)卵量有所下降(P＜0.05); 隨脅迫時間的延長(15d)和脅迫濃度的升高, 各處理中海洋青鳉的產(chǎn)卵量逐漸相近(P＞0.05), 并與第4天相比不存在顯著差異(P＞0.05,圖6)。

2.7 各指標間相互關(guān)系分析

在海洋青鳉魚銅或鎘脅迫下各指標間的相關(guān)性分析見圖7。銅或鎘脅迫對青鳉的LA含量影響是不同的, 隨銅濃度的升高而降低, 隨鎘濃度的升高而升高(圖7a、7b)。隨銅或鎘脅迫時間的延長,雌雄魚體內(nèi)LA含量均降低。在雌魚受銅或鎘脅迫時, 體內(nèi)T含量與LA含量呈正相關(guān)關(guān)系, 銅脅迫的相關(guān)性系數(shù)大于鎘脅迫(圖7c、7d), T與FSH/LH間也有良好的正相關(guān)關(guān)系。此外, 短期(4d)內(nèi)銅脅迫對雌魚產(chǎn)卵量沒有影響, 但長期(15d)脅迫明顯影響產(chǎn)卵量, 并隨濃度升高而生殖能力下降(圖7e)。而鎘脅迫對產(chǎn)卵量有急性影響(僅中間濃度(G2)處理), 長期無影響, 且與濃度間也無密切關(guān)系(圖7f)。同時回歸分析也表明, LA與產(chǎn)卵量間、重金屬離子與產(chǎn)卵量也有密切關(guān)系, 而回歸方程的參數(shù)體現(xiàn)了不同離子脅迫的影響差異 (圖7g、7h)。

圖6 不同濃度銅或鎘脅迫對海洋青鳉產(chǎn)卵的影響Fig. 6 Fecundities of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

圖7 銅或鎘脅迫過程中魚體各指標間的關(guān)系分析Fig. 7 Correlative analysis of related indicators of fish in copper or cadmium poisoning test

3 討論

機體疲勞主要體現(xiàn)為能量或肌肉力量的下降[27],表現(xiàn)為一系列生化指標的變化, 如乳酸(LA)上升、血尿素氮(BUN)上升和乳酸脫氫酶(LDH)活性上升等[28,29]。肌肉中LA增加會導(dǎo)致氫離子濃度升高, 從而造成機體疲勞, LDH作用是催化LA重新形成丙酮酸, 消除LA積累[30]。因此, LA和LDH兩個指標可以用來反應(yīng)機體疲勞及能量消耗程度[31]。在本試驗中, 海洋青鳉體內(nèi)的LA水平(圖1), 短期銅脅迫時有所升高, 而后逐漸減少到低于對照組。一是表明魚體逐漸適應(yīng)了銅的低毒脅迫, 生理狀態(tài)逐漸恢復(fù);二是低濃度的銅離子有生物活性作用, 微量的重金屬對水體中的生物是有益的[32]。而鎘脅迫與銅脅迫剛好相反, 隨鎘濃度升高而顯著上升, 盡管隨著魚體的適應(yīng)LA略有下調(diào), 但仍保持在高位狀態(tài)。從LDH的變化也能看出(圖2), 銅脅迫前期略有升高后逐漸下降, 而鎘脅迫下LDH活性逐漸增強。LDH活性可反應(yīng)機體能量代謝的水平, 肌體受損也會導(dǎo)致LDH活性增高[33,34]。從上述的LA和LDH變化看, 海洋青鳉對銅脅迫的適應(yīng)快, LDH也無較大的波動, 表明低濃度銅基本沒有對海洋青鳉造成損傷, 僅在前期抗脅迫中機體能量有所消耗。而鎘脅迫短期內(nèi)沒有出現(xiàn)太大影響, 但到試驗后期海洋青鳉才表現(xiàn)出疲勞損傷特性(LDH活性高)。睪酮(T)也有一定的消除疲勞功效[35]。在本試驗中T與LDH的變化較為吻合, 表明T可能與LDH共同作用,減少體內(nèi)LA的積累。但T的變化存在著兩性間的差異性(圖3), 低濃度重金屬的脅迫對雌魚T的影響更大些, 濃度下降也更明顯。因此, 從結(jié)果看雄魚的抗疲勞能力提高了, 而雌魚T下降, 疲勞程度卻加重了。根據(jù)相關(guān)分析分析(圖7), LA與雌魚T間有很強的相關(guān)性(圖7c、7d), 可以推斷雌魚受到銅或鎘脅迫后, LA含量發(fā)生改變, 進而引起T與LDH的相應(yīng)變化。而銅、鎘所造成的脅迫效應(yīng)不同, 應(yīng)該與魚體對不同毒物的適應(yīng)能力有關(guān)。

作為性激素, T還對精子發(fā)生、卵泡發(fā)育及維持性器官正常有重要意義[36], 在雌性和雄性的生殖生理過程中都很重要[37]。一般認為, T通過調(diào)控FSH和LH的合成與分泌, 發(fā)揮生理作用[36,38,39], 本試驗也顯示T與FSH/LH間有良好的正相關(guān)關(guān)系。而FSH/LH與雌性的產(chǎn)卵密切相關(guān)[40—42]。本試驗在銅或鎘脅迫下的海洋青鳉體內(nèi)FSH變化顯著(圖4),但整體趨勢與T相似。因此, 可以推斷雌魚T含量與其產(chǎn)卵量間也存在密切的正相關(guān)關(guān)系。前述中, 雌魚對重金屬較敏感, 體內(nèi)的T變化比較大, 因此對產(chǎn)卵量的影響也比較大。LA與T間有良好的關(guān)系, 但根據(jù)上述的分析, 應(yīng)該是LA升高, 而后LDH和T升高以消除LA積累, LDH和T的上升應(yīng)該要滯后于LA的變化(從本實驗看, 這種滯后的時間應(yīng)該是不同的毒物是不一樣的, 這需進一步進行驗證)?？梢酝茢郘A升高造成產(chǎn)卵量減少, 當然是由于個體適應(yīng)或抵抗毒物脅迫消耗能量所致, 如銅脅迫試驗結(jié)果; 至于鎘脅迫, 由于青鳉對鎘適應(yīng)比較慢, 本試驗養(yǎng)殖時間不足, 因此產(chǎn)卵量下降現(xiàn)象還未出現(xiàn)。綜上, 可以初步建立以下的動態(tài)關(guān)系： 雌性青鳉的LA水平(疲勞程度)-T/FSH(激素變化)-產(chǎn)卵量(繁殖能力)。可以利用這個關(guān)系鏈開展環(huán)境脅迫程度的分析。盡管銅或鎘低濃度脅迫均對海洋青鳉的生理生化產(chǎn)生影響, 且有關(guān)的生理生化指標間存在較好的相關(guān)性。但是, 有機體內(nèi)的各項指標都是動態(tài)變化的, 而水生生物對低濃度重金屬也有適應(yīng)性,只有超出了機體的調(diào)節(jié)能力, 才會影響到生物的生理穩(wěn)態(tài)[43]。不過, 通過本實驗發(fā)現(xiàn), 生物對不同重金屬種類的響應(yīng)不同, 且存在性別差異, 還有采樣的時間點等都會對結(jié)果產(chǎn)生影響, 影響結(jié)果的準確性。因此, 還需要開展更多的試驗研究, 完善相關(guān)關(guān)系鏈分析, 為準確開展生物監(jiān)測提供依據(jù)。

4 結(jié)論

綜上所述, 本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的銅或鎘脅迫都會影響海洋青鳉的生理生化指標, 且這種影響呈現(xiàn)出明顯的性別差異性。低濃度的銅或鎘脅迫導(dǎo)致雌性青鳉體內(nèi)的LA升高, 限制了性激素(T、FSH)分泌, 從而導(dǎo)致產(chǎn)卵量下降, 且這種關(guān)系與銅或鎘濃度間呈正相關(guān)關(guān)系, 并隨脅迫時間的延長而效應(yīng)下降。但銅或鎘脅迫對這種關(guān)系的影響也有較大的差異, 如對應(yīng)的相關(guān)回歸方程的斜率、系數(shù)及變化周期等。