黃子慧?陳煜森?馬曉瑭?許小冰?李嬋娣

【摘要】由SMPD1基因編碼的酸性鞘磷脂酶不僅介導(dǎo)溶酶體代謝、參與膜結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且對(duì)鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺起關(guān)鍵作用。細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞分泌或細(xì)胞膜上脫落的一種具有多功能的異質(zhì)膜囊泡。研究顯示，酸性鞘磷脂酶及其下游代謝物神經(jīng)酰胺與細(xì)胞外囊泡的分泌釋放相關(guān)。如今細(xì)胞外囊泡的生物發(fā)生越來越受到人們的關(guān)注，該文就SMPD1基因?qū)?xì)胞外囊泡生物發(fā)生的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】SMPD1基因;酸性鞘磷脂酶;神經(jīng)酰胺;細(xì)胞外囊泡

Research progress on SMPD1 gene and extracellular vesicle biogenesis Huang Zihui， Chen Yusen， Ma Xiaotang， Xu Xiaobing， Li Chandi. Department of Neurology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

Correspondent author， Chen Yusen， E-mail： chenyusen925@ 163. com

【Abstract】Acid sphingomyelinase encoded by SMPD1 gene not only mediates lysosomal metabolism， participates in membrane structure regulation and signal transduction， but also plays a key role in the conversion of sphingomyelin into ceramide. Extracellular vesicles are multifunctional vesicular vesicles that are secreted by cells or shed on the cell membrane. Studies have shown that acid sphingomyelinase and its downstream metabolite ceramide are associated with the secretion and release of extracellular vesicles. Nowadays， the bioecogenesis of extracellular vesicles has attracted more and more attention. This article reviews the research status of SMPD1 gene on extracellular vesicle biogenesis.

【Key words】SMPD1 gene;Acid sphingomyelinase;Ceramide;Extracellular vesicle

細(xì)胞外囊泡（EV）可包裹生物活性蛋白、糖類、脂質(zhì)和廣泛核酸，作為獨(dú)特載體在體液中穩(wěn)定存在，起細(xì)胞間通訊、生物標(biāo)志物、治療等作用[1]。越來越多研究表明EV在多種疾病的預(yù)防、診斷、治療、預(yù)后評(píng)估中具有良好的應(yīng)用前景。因此，明確EV生物發(fā)生的作用和分子機(jī)制對(duì)疾病的預(yù)防和治療都有著重要意義。關(guān)于EV的命名和分類尚未統(tǒng)一，? 一般認(rèn)為其包括外泌體、微囊泡（也稱為微粒）、外胚層、遷移體和凋亡小體。本文主要討論2種被廣泛研究的EV，即外泌體和微囊泡。SMPD1基因介導(dǎo)編碼的酸性鞘磷脂酶（ASMase）及其下游代謝物神經(jīng)酰胺可通過改變脂質(zhì)成分使細(xì)胞膜特性劇烈變化而觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)事件并改變膜曲率，參與EV的分泌與釋放。研究SMPD1基因編碼的ASMase有望通過調(diào)控EV生物發(fā)生為疾病尋找到新的治療靶點(diǎn)。

一、SMPD1基因概述

1. SMPD1基因及其所編碼的蛋白

SMPD1基因的細(xì)胞遺傳學(xué)位置在11號(hào)染色體的短臂（11p15.1 ～ 11p15.4），其模板DNA全長約 2.5 kb，包括 1890 bp 的開放閱讀框，編碼 629 個(gè)氨基酸。其編碼酶的6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)中有5個(gè)被占據(jù)，寡糖側(cè)鏈含有甘露糖-6-磷酸殘基，這是溶酶體蛋白的典型特征。此外對(duì)ASMase二硫鍵結(jié)構(gòu)的研究顯示，氨基酸殘基629處的末端半胱氨酸是唯一不參與分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸。事實(shí)上，這一末端半胱氨酸殘基必須去除才能獲得完整的ASMase活性，因此該殘基在成熟蛋白質(zhì)中的保留可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)不具活性、分子量較高的聚集物[2]。

2. ASMase

SMPD1基因編碼的ASMase屬于鞘磷脂酶家族，可在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。ASMase在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用與其重組質(zhì)膜的能力緊密相關(guān)。ASMase對(duì)鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺起關(guān)鍵作用，前者在一定外源刺激下能快速被活化并釋放到細(xì)胞表面，水解細(xì)胞膜上鞘磷脂，使神經(jīng)酰胺水平在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)迅速上升。富含神經(jīng)酰胺的結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步融合，于細(xì)胞質(zhì)膜外小葉上形成神經(jīng)酰胺大平臺(tái)，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)密度，并通過改變膜物理性質(zhì)或直接的神經(jīng)酰胺-蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)受體二聚化以及其他蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。目前認(rèn)為，ASMase有助于重組細(xì)胞表面并激活微域內(nèi)的信號(hào)蛋白，從而增強(qiáng)或降低下游信號(hào)的閾值。另神經(jīng)酰胺可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、鞘氨醇等一系列生物活性脂質(zhì)，通過脂質(zhì)成分的改變促進(jìn)細(xì)胞膜特性劇烈變化而觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)事件[3]。神經(jīng)酰胺和S1P作為信號(hào)分子中的主要鞘脂控制許多細(xì)胞活動(dòng)，包括血管生成、炎癥、細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、自噬、轉(zhuǎn)移等。ASMase不僅介導(dǎo)了溶酶體代謝、參與膜結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥、細(xì)菌感染、凋亡、腫瘤調(diào)控、脫髓鞘等過程[4-7]。可見，SMPD1基因編碼的ASMase對(duì)細(xì)胞和組織的正常結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要。

3. SMPD1基因與疾病

SMPD1基因缺失會(huì)引起尼曼-皮克?。∟PD），NPD是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，屬于溶酶體貯積癥[8]。ASMase缺乏可表現(xiàn)出A型或B型NPD。A型NPD患兒通常伴隨著神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，并在出生6個(gè)月內(nèi)逐漸出現(xiàn)肝脾腫大、生長受限和明顯的肺部感染等。B型NPD患者很少或不出現(xiàn)神經(jīng)變性，其最常見的臨床表現(xiàn)是肝脾增大，一般能存活到成年，發(fā)病年齡可從幼兒期到成年期。

除NPD外，ASMase活性的改變還與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病息息相關(guān)。研究者在病例對(duì)照分析研究中發(fā)現(xiàn)，SMPD1基因中的Leu-Ala（Val）重復(fù)變異增加了中國漢族人群帕金森病的患病風(fēng)險(xiǎn)[9]。SMPD1基因敲除或敲減可使HeLa細(xì)胞中α-突觸核蛋白水平增加，而帕金森病患者中SMPD1突變，ASMase水平降低，使帕金森病發(fā)生提早3.5 ～ 5.8年[10]。在阿爾茲海默?。ˋD）中，AD患者和AD小鼠的成纖維細(xì)胞、腦或血漿中ASMase增加，導(dǎo)致自噬空泡數(shù)量增加，從而引起自噬降解缺陷。在AD小鼠模型中，抑制ASMase可減少β淀粉樣蛋白沉積并挽救受損記憶[11]。在創(chuàng)傷性腦損傷中，ASMase的轉(zhuǎn)錄后激活可導(dǎo)致?lián)p傷后第1周線粒體中鞘氨醇選擇性增加，伴隨線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性降低和Nod樣受體蛋白3炎癥小體活化，使線粒體呼吸鏈紊亂及促進(jìn)神經(jīng)炎癥。抑制ASMase還可以減輕創(chuàng)傷性腦損傷早期反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞病變[12]。研究表明，ASMase在老年人和老年小鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和血漿中升高，其通過增加細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷介導(dǎo)的胞吞作用導(dǎo)致血腦屏障損傷和加速神經(jīng)元功能障礙。ASMase的基因敲減和內(nèi)皮特異性敲減可改善血腦屏障破壞和衰老期間的神經(jīng)認(rèn)知障礙[13]。

二、EV的生成與分泌機(jī)制

外泌體是先在多泡體內(nèi)形成管腔內(nèi)囊泡（ILV）然后與質(zhì)膜融合而分泌形成的，代表粒徑40 ～ 100 nm的囊泡群。外泌體在多泡體中形成ILV，需要招募轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）到ILV形成部位[14]。在多泡體中產(chǎn)

生ILV的分子基礎(chǔ)是ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4種蛋白組成的復(fù)合體和輔助蛋白ALIX（也稱為PDCD6IP）。ESCRT 0識(shí)別內(nèi)體膜外部的泛素化蛋白質(zhì)。ESCRTⅠ將泛素化的內(nèi)容物結(jié)合在內(nèi)體膜上，激活ESCRTⅡ。ESCRT Ⅲ通過ALIX募集，并與ESCRT-Ⅰ復(fù)合物上的TSG101結(jié)合。ALIX與TSG101結(jié)合，起到連接ESCRT I和ESCRT Ⅲ的作用。隨后，募集去泛素化酶，從內(nèi)容物蛋白中去除泛素標(biāo)簽以完成分選過程。最后，ESCRT Ⅲ被AAA-ATPase SKD1分解并回收利用以進(jìn)行另一輪內(nèi)容物招募?？傊珽SCRTⅠ和Ⅱ被認(rèn)為是啟動(dòng)ILV萌芽的過程，而ESCRT Ⅲ則完成了這一過程。然而并非所有外泌體的形成都是依賴ESCRT途徑的，一些細(xì)胞在ESCRT復(fù)合物敲除的情況下仍然能產(chǎn)生外泌體。

微囊泡是粒徑大小為100 nm ～ 1 mm、由質(zhì)膜衍生的比外泌體更大的異質(zhì)囊泡群。其直接由質(zhì)膜發(fā)芽起泡釋放而成，并可能包含細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)元件，涉及皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白重組和隨后的質(zhì)膜向外突出和分離。鈣離子依賴性酶機(jī)制包括氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶、拼接酶和鈣蛋白酶驅(qū)動(dòng)膜磷脂不對(duì)稱重排，即磷脂酰絲氨酸從內(nèi)小葉到細(xì)胞表面的暴露，導(dǎo)致膜的物理性彎曲和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，這有利于膜出芽和微囊泡形成[15]。

細(xì)胞如何分泌與釋放EV尚處于初級(jí)研究階段，有研究表明這些過程需要細(xì)胞骨架蛋白如微絲及微管蛋白、動(dòng)力蛋白、小鳥苷三磷酸（GTP）酶以及融合可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白附著蛋白（SNARE）和錨定蛋白的參與。亦有研究表明某些膜脂在調(diào)節(jié)EV分泌中起作用，如由二酰甘油激酶或磷脂酶D活性而產(chǎn)生的磷脂酸可影響外泌體分泌。

三、ASMase與EV

1. ASMase與EV

ASMase與病理?xiàng)l件下紅細(xì)胞釋放EV相關(guān)。據(jù)報(bào)道，鐮狀細(xì)胞病的質(zhì)膜應(yīng)激和改變，增強(qiáng)了ASMase的活性，導(dǎo)致紅細(xì)胞產(chǎn)生的EV增加[16]。使用ASMase間接抑制劑阿米替林治療可減少鐮狀細(xì)胞病的體外和體內(nèi)模型中EV的產(chǎn)生，這提示了減輕病情的可能治療方法。另一項(xiàng)研究表明，ASMase與內(nèi)皮細(xì)胞中香煙煙霧誘發(fā)的EV釋放有關(guān)[17]。暴露于香煙煙霧后，內(nèi)皮細(xì)胞自身收縮并從縮回絲狀偽足結(jié)構(gòu)的尖端釋放EV。使用ASMase抑制劑丙咪嗪可明顯降低香煙煙霧誘導(dǎo)的EV產(chǎn)生，暴露于香煙煙霧后缺乏ASMase小鼠血漿中EV水平降低，而在內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)ASMase小鼠中循環(huán)EV水平增加，這些結(jié)果均證實(shí)了ASMase的激活在香煙煙霧誘導(dǎo)的EV釋放中起關(guān)鍵作用。

2. ASMase與外泌體

有研究表明，神經(jīng)酰胺合成參與多泡體腔內(nèi)囊泡的形成不依賴ESCRT生物發(fā)生途徑，多泡體與質(zhì)膜融合后，囊泡以外泌體的形式釋放。然而可使鞘脂酶水解成磷酸膽堿和神經(jīng)酰胺的除了ASMases外，還包括了其他鞘磷脂酶，其中對(duì)外泌體生物發(fā)生研究較多的是中性鞘磷脂酶（NSMase）。在少突膠質(zhì)細(xì)胞系（Oli-Neu）外泌體的分選機(jī)制研究中，用NSMase抑制劑處理Oli-Neu細(xì)胞后，外泌體釋放明顯減少。NSMase2的小干擾RNA耗盡也證實(shí)了酶參與包裹蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP）外泌體的形成和分泌。在此基礎(chǔ)上，有學(xué)者提出PLP陽性外泌體的生物發(fā)生在富含鞘磷脂的膜結(jié)構(gòu)域，它們通過形成神經(jīng)酰胺微結(jié)構(gòu)域進(jìn)而聚結(jié)成更大的結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)囊泡出芽。神經(jīng)酰胺的錐形結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)內(nèi)體膜的自發(fā)負(fù)曲率，有利于多泡體內(nèi)部形成內(nèi)囊泡。隨后的研究顯示，給予外源性神經(jīng)酰胺可劑量依賴性地增加從多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中釋放的外泌體數(shù)量[18]。鞘磷脂合酶抑制劑D609抑制神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為鞘磷脂引起神經(jīng)酰胺升高促進(jìn)了外泌體分泌[19]?？偠灾?，神經(jīng)酰胺對(duì)外泌體釋放十分重要。

在人巨噬細(xì)胞系U937中，ASMase通過氧化LDL的免疫復(fù)合物對(duì)表面Fcγ受體的作用而激活，使含有IL-1β的外泌體釋放[20]。ASMase與外泌體釋放的研究目前報(bào)道較少。但既然ASMase也可作用于鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺，那么其對(duì)外泌體釋放可能也具有重要調(diào)控作用，值得進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-11-01）

（本文編輯：林燕薇）