潘潔?宋慧東?王巧瑜?蕭間開

【摘 要】目的 研究熱休克蛋白70（HSP70）-肝癌抗原肽（SMMC7721人肝癌細(xì)胞株）復(fù)合物修飾的樹突狀細(xì)胞（DC）對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（CIK）細(xì)胞的增殖活性及表型的影響。方法 獲取健康供者的外周血單個核細(xì)胞（PBMC），培養(yǎng)2 h，貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)分化DC，非貼壁細(xì)胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，DC生長第7日開始負(fù)載HSP70（A組）、肝癌抗原肽（B組）、HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物（C組），另設(shè)單純DC組（D組），流式細(xì)胞檢測CD80、CD86的表達(dá)，體外構(gòu)建HSP70-抗原肽復(fù)合物-DC瘤苗，并將其和CIK細(xì)胞按1∶10的比例混合培養(yǎng)5 d，四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖能力，以流式細(xì)胞儀檢測DC及CIK細(xì)胞膜表面分子表達(dá)。結(jié)果 HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物可促進(jìn)DC成熟，DC表面分子CD86、CD80在C組表達(dá)均較D組高（P均< 0.01）。HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物-DC瘤苗可明顯刺激CIK細(xì)胞的增殖。HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物-DC瘤苗與CIK共培養(yǎng)可使CIK細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+的表達(dá)提高，與單純培養(yǎng)CIK細(xì)胞比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。結(jié)論 HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物能提高DC表面分子CD80、CD86 等表達(dá)，誘導(dǎo)DC的成熟，HSP70-抗原肽復(fù)合物-DC瘤苗與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯增加CIK細(xì)胞的增殖活性，提高CIK細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】熱休克蛋白70-肝癌抗原肽復(fù)合物;熱休克蛋白70;樹突狀細(xì)胞;

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞;免疫治療

Effect of HSP-70 hepatoma antigen peptide complex-modified dendritic cells on proliferation activity and phenotype of CIK cells Pan Jie， Song Huidong， Wang Qiaoyu， Xiao Jiankai. Department of Gastroen-terolgy， Guangzhou No.12 Hospital， Guangzhou 510620， China

【Abstract】Objective To evaluate the effect of dendritic cells（DC） modified by heat shock protein 70（HSP70） -SMMC7721 tumor peptide complex upon the proliferation activities and phenotype changes of cytokine-induced killer（CIK） cells.? Methods Peripheral blood mononuclear cells were obtained from healthy donors and cultured for 2 h. The adherent cells were induced to differentiate DC and non-adherent cells were utilized to induce CIK cells. DCs were loaded with HSP70 （group A）， hepatoma antigen peptide （group B） and HSP70-hepatoma antigen peptide complex （group C） on the seventh day of growth， and DC alone were allocated into group D. The expression of CD80 and CD86 was detected by flow cytometry. HSP70-antigen peptide complex-DC tumor vaccine was constructed in vitro， and co-cultured with CIK cells at a ratio of 1：10. The proliferation of CIK was measured by MTT assay. The expression of molecules on the membrane surface of DCs and CIK was observed by flow cytometry.? Results HSP70-SMMC7721 peptide complex could accelerate the maturity of DC. The expression levels of CD80 and CD86 on the membrane surface of DC in group C were significantly higher compared with those in group D （both P < 0.01）. HSP70-antigen peptide complex-DC tumor vaccine could remarkably stimulate the proliferation of CIK cells. The expression levels of CD3+CD8+， CD3+CD56+ in CIK cells were significantly up-regulated after the co-culture of HSP70-antigen peptide complex-DC tumor vaccine and CIK compared with those after the culture of CIK cells alone （all P < 0.05）.? Conclusions HSP70-SMMC7721 tumor peptide complex can up-regulate the expression levels of CD80 and CD86 on the membrane surface of DC and induce the maturity of DC. The co-culture of HSP70-antigen peptide complex-DC tumor vaccine and CIK cells can significantly enhance the proliferation activity and up-regulate the expression levels of CD3+CD8+， CD3+CD56+ in CIK cells.

【Key words】Heat shock protein 70-SMMC7721 tumor peptide complex;Heat shock protein 70;

Dendritic cell;Cytokine-induced killer;Immunotherapy

原發(fā)性肝癌是高度惡性的腫瘤，病死率高居我國腫瘤的第二位。目前晚期肝癌尚無特效的治療方法。近年來，隨著生物治療技術(shù)的突破，為肝癌的治療提供了新的模式，其中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（CIK）細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）的抗腫瘤免疫治療是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前已有不少DC-CIK 細(xì)胞免疫治療用于多種實(shí)體腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究，也取得到了一定的成果，但在晚期肝癌治療方面尚不成熟[1]。由于肝癌患者體內(nèi)的DC存在功能缺陷，從而不能誘發(fā)抗原特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答， 因此，如何在體外誘導(dǎo)功能性DC應(yīng)用于肝癌患者的主動免疫治療，有重要的臨床意義。本研究擬構(gòu)建熱休克蛋白70（HSP70）-肝癌抗原肽復(fù)合物修飾DC瘤苗，并將此DC瘤苗和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察DC-CIK的增殖活性和表型變化。探討HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物對DC成熟的作用及其對CIK細(xì)胞群增殖的影響，為將來進(jìn)一步應(yīng)用于肝癌的免疫治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材 料

胎牛血清（FBS）、完全1640培養(yǎng)基和淋巴細(xì)胞分離液購自美國Gibco公司;HSP70購自美國Cal-biochem公司;SMMC-7721肝癌細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室液氮保存株;人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、人IL-4購自peprotech公司;異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD86、CD80單克隆抗體購自美國Immunotech公司;FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、CD4 單抗，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的CD8、CD56單抗購自Santa Cruz 公司;二甲基亞砜及四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司。

二、方 法

1.腫瘤抗原制備

取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，細(xì)胞反復(fù)凍融3次（-80℃與37℃，10 分/次），顯微鏡下觀察無細(xì)胞結(jié)構(gòu)后， 3000 r/min離心30 min，離心半徑為10 cm，用濾器將上清過濾于無菌EP管中（相當(dāng)于癌細(xì)胞107/ml），放置在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2. SMMC-7721抗原肽與 HSP70 體外結(jié)合

按 Blanchere等[2]報道的方法，用磷酸鹽緩沖液（PBS）將HSP70、SMMC-7721抗原肽、MgCl2、ADP調(diào)整各種成分的比例，使最終濃度為HSP70 120 μg/ml、抗原肽75 mg/L、MgCl2 1 mmol/L、ADP 1 mmol/L，充分混勻后在 37℃水浴中反應(yīng)2 h備用。

3. DC的體外培養(yǎng)

采集健康供者外周抗凝血50 ml，用淋巴細(xì)胞分離液（ Ficoll）分離出外周血單個核細(xì)胞 （PBMC），用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為（4 ～ 5）×106/ml，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。收集未貼壁細(xì)胞待用，留下的貼壁細(xì)胞加入含1000 U/ml的GM-CSF、500 U/ml的IL-4和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隔日半量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子（首次濃度的1/2），培養(yǎng)7 d后收集的細(xì)胞即為未致敏DC。

4. CIK細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增

用含10%人AB血清的1640培養(yǎng)液將方法3收集的非貼壁細(xì)胞調(diào)濃度為（2 ～ 3）×106/ml，加入1000 U/ml的IFN-α懸浮培養(yǎng)，24 h后加入1

μg/ml的CD3單克隆抗體和1000 U/ml的IL-2，繼續(xù)培養(yǎng)1周，每隔3 d半量換液1次，并補(bǔ)充等量的IL-2，用1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為（2 ～ 3） ×106/ml備用。

5. HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物修飾DC及檢測細(xì)胞表型

收集方法3制備的未致敏DC，用1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)（100 μl/孔），分別加入下列物質(zhì)：HSP70組（A組），加入HSP70（120 μg/ml）;肝癌抗原組（B組），按肝癌細(xì)胞（SMMC7721）與DC以10∶1的比例加入肝癌抗原（相當(dāng)于106 /ml）;HSP70+肝癌抗原組（C組），加入方法2制備的HSP70-肝癌抗原復(fù)合物120 μg/ml;單獨(dú)DC組（D組）。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后（即開始培養(yǎng)的第9日）分別收集4組DC備用。各組收集部分細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)為每個試管中1×104個細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的抗CD80、CD86單抗4℃反應(yīng)45 min，用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測DC細(xì)胞表型。

6. DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)

將方法5制備的各組DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞按1∶10混合培養(yǎng)5 d得到DC-CIK細(xì)胞。

7.共培養(yǎng)后CIK細(xì)胞表型的測定

在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第0、14日分別取少量細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測定，方法5制備的C組與CIK共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測定。DC-CIK調(diào)濃度為5×106/ml， 分別加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、CD4和PE標(biāo)記的鼠抗人CD8、CD56各20 μl， 4℃避光孵育40 min，F(xiàn)CM檢測CIK細(xì)胞表型。

8.不同組DC對CIK細(xì)胞增殖活性的影響

設(shè)單純CIK為對照組，收集方法5制備的致敏DC，加入絲裂霉素A（25 μg/ml），37℃孵育30 min。調(diào)細(xì)胞濃度為1×105? /ml，與CIK細(xì)胞按1∶10比例混合，將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，于37℃培養(yǎng)3 d，加入MTT 50 μl（3 mg/ml），后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，3000 r/min離心10 min，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μl（400 mmol/L）振蕩10 min，于570 nm處測定吸光度（OD）值，每組6復(fù)孔，重復(fù)3次取均值，分別計算各組刺激指數(shù)（SI）。SI =實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析，所有數(shù)據(jù)均以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，前、后比較用配對t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、細(xì)胞的表型分析

1.DC表型分析

經(jīng)FCM分析表明，抗原刺激后DC的CD80、CD86表達(dá)陽性率明顯增加，符合成熟DC表型變化，見表1。A、B、C 3組與D組比較均升高（P均< 0.05），其中以C組表達(dá)率最高，A、B、C 3組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。

2.CIK表型分析

經(jīng)FCM分析表明，隨著培養(yǎng)時間的增加， CIK細(xì)胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的百分含量逐漸上升;在培養(yǎng)的第14日，2組細(xì)胞的CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞群百分含量均較培養(yǎng)前明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.01），與DC共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的百分含量更高，與單純CIK組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05），見表2。

3.不同組別DC對CIK細(xì)胞增殖作用的影響

在培養(yǎng)的第3日CIK細(xì)胞開始增殖，體積變大、細(xì)胞質(zhì)豐富，并出現(xiàn)多形性，第5日以后進(jìn)入快速增殖期，第9日與DC細(xì)胞共培養(yǎng)后，CIK細(xì)胞具有更高的增殖活性，14 d左右達(dá)到增殖高峰，MTT法顯示各組的OD值分別為：A組0.44± 0.02、B組0.44±0.02、C組0.62±0.16、D組0.23±0.01、對照組0.18±0.01，A、B、C、D 4組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05），其中以C組為最高，A、B、C、D 4組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。SI以C組為最高，與A、B、D 3組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。

討論

DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能激活初始T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在抗腫瘤免疫方面起著主導(dǎo)作用[3]。只有成熟的DC才能刺激淋巴細(xì)胞增殖，從而激發(fā)有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而腫瘤患者體內(nèi)DC存在數(shù)量和功能上的缺陷，是腫瘤免疫缺陷的主要原因，因此，如何充分激活并發(fā)揮 DC的功能活性，將成為抗腫瘤免疫治療的關(guān)鍵[4]。

HSP70家族是一類重要的應(yīng)激蛋白，作為一種分子伴侶，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的佐劑作用和激活DC的能力， 在抗腫瘤免疫中可發(fā)揮重要作用[5]。腫瘤細(xì)胞抗原肽屬于小分子量物質(zhì)，抗原提呈細(xì)胞DC等難以將它們捕獲，DC表面存在HSP70高親和力受體CD91，HSP70可以加工腫瘤抗原并遞呈到DC細(xì)胞表面，從而活化T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生特異性的抗腫瘤細(xì)胞免疫[6]。因此，HSP 具有強(qiáng)有力的增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能，在抗腫瘤免疫中可發(fā)揮重要的輔助作用，對開發(fā)腫瘤疫苗具有重要的意義[7]。

CIK細(xì)胞是一種非MHC限制性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)CD3+CD56+，具有廣譜、強(qiáng)效的殺傷腫瘤細(xì)胞特性。有研究顯示將DC和CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)時，細(xì)胞因子釋放增加，可使CIK細(xì)胞增殖速度加快、細(xì)胞毒性增強(qiáng)，并使其殺瘤活性增高[8]。因此，本研究從細(xì)胞研究水平，應(yīng)用HSP70與人SMMC-7721肝癌細(xì)胞凍融抗原修飾DC，促進(jìn)DC的活化成熟，然后將活化的DC與CIK細(xì)胞按比例共同培養(yǎng)，觀察DC和CIK的增殖能力及表型的變化。

研究結(jié)果表明，肝癌凍融抗原和HSP70聯(lián)合作用于DC與肝癌凍融抗原修飾DC均可以誘導(dǎo)DC高表達(dá)表面分子CD80、CD86，促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)DC刺激CIK增殖的能力，其中以肝癌凍融抗原和HSP70聯(lián)合作用組的DC更加成熟，同單獨(dú)應(yīng)用肝癌凍融抗原及HSP70相比，其誘導(dǎo)CIK細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng)，與M?rten等[9]研究結(jié)果相似，并且DC-CIK細(xì)胞群的增殖活性比同源CIK細(xì)胞更強(qiáng)，共培養(yǎng)5 d后DC-CIK的刺激指數(shù)較單獨(dú)CIK組明顯提高，同時CIK細(xì)胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例明顯增高，說明大量成熟DC可以進(jìn)一步促進(jìn)CIK細(xì)胞的成熟，其機(jī)制可能與成熟DC分泌高水平的IL-2、IL-12和IFN等細(xì)胞因子有關(guān)[10]。本研究為DC-CIK應(yīng)用于肝癌治療提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，是將主動特異性免疫治療和過繼免疫治療相結(jié)合產(chǎn)生更有效的腫瘤免疫治療方法的初步探索。

綜上所述，HSP70-肝癌抗原肽復(fù)合物能提高 DC 表面分子 CD80、CD86等表達(dá)，誘導(dǎo) DC 的成熟，HSP70-抗原肽復(fù)合物-DC瘤苗與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯增加CIK細(xì)胞的增殖活性，提高CIK細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+ 的表達(dá)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-10-12）

（本文編輯：楊江瑜）