梁卓政?馮定云?吳文斌?朱家馨?張?zhí)焱?/p>

【摘要】目的 探討體外高濃度頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（SCF）誘導銅綠假單胞菌后耐藥譜的變化。方法 收集4株SCF敏感的臨床銅綠假單胞菌以及1株實驗室標準株，經(jīng)過體外3.2倍最低抑菌濃度（MIC）的SCF誘導50代后，得到耐藥銅綠假單胞菌。采用微量肉湯稀釋法測定SCF、美羅培南等12種抗菌藥物對誘導耐藥株的MIC，根據(jù)2017年臨床與實驗室標準化所（CLSI）M100-S29的藥物敏感性標準對結(jié)果進行判定。利用實時定量PCR（RT-qPCR）對銅綠假單胞菌的耐藥相關(guān)基因的表達進行檢測。結(jié)果 經(jīng)過3.2倍 MIC的SCF誘導50代后，銅綠假單胞菌對抗假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抗菌藥物的MIC平均增加14.0倍，對抗假單胞菌的頭孢菌素類抗菌藥物MIC平均增加9.0～16.0倍，對美羅培南的MIC至少增加4.0倍，但是對亞胺培南的MIC影響很小，對單環(huán)-β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物MIC平均增加6.0倍，對喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物的MIC大多保持不變。RT-qPCR結(jié)果顯示，SCF誘導后外排泵基因mexD表達升高，孔道蛋白OprD表達降低（P均< 0.05）。結(jié)論 SCF使用可引起敏感的銅綠假單胞菌耐藥性改變，誘導成對多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的銅綠假單胞菌，甚至耐碳青霉烯銅綠假單胞菌。外排泵mexD的升高和孔道蛋白OprD的降低是體外SCF誘導銅綠假單胞菌耐藥的重要機制。臨床使用SCF需要謹慎合理，以減少多重耐藥銅綠假單胞菌的產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌;頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉;多重耐藥;碳青霉烯

The effect of in vitro-selection by cefoperzone-sulbactam on antibiotics resistance of Pseudomonas aeruginosa Liang Zhuozheng， Feng Dingyun， Wu Wenbin， Zhu Jiaxin， Zhang Tiantuo. Department of Resp- iratory Medicine， the Third Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zhang Tiantuo， E-mail： zhtituli@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the variations in the drug susceptibility of Pseudomonas aeruginosa （P. aeruginosa） isolates after the in vitro-selection with high-dose cefoperazone-sulbactam （SCF）. Methods Four clinical isolates of SCF-sensitive P. aeruginosa and 1 standard laboratory isolate were collected. The drug-resistant P. aeruginosa isolates were obtained after 50 generations of SCF induction at a concentration of 3.2×MIC. The antimicrobial susceptibility of 12 antibiotics， such as SCF and meropenem， was determined by disk diffusion method， and the results were judged according to the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI） M100-S29 guideline in 2017. The expression of resistance-related genes in P. aeruginosa was detected by real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. Results After 50 generations of SCF induction at a concentration of 3.2×MIC， the MIC of P. aeruginosa against anti-pseudomonal β-lactam+β-lactamase inhibitors was increased by 14 times on average. In addition， the MIC to anti-pseudomonal cephalosporins was elevated by 9.0-16.0 times on average. Moreover， the resistance rate to meropenem was increased by at least 4.0 times. However， the MIC to imipenem was not significantly affected. For monobactams， the MIC was increased by 6.0 times on average. The susceptibility to anti-pseudomonal fluoroquinolones and aminoglycoside remained largely unchanged. RT-qPCR showed that the expression of the efflux pump gene mexD was significantly up-regulated， whereas that of the outer membrane porin OprD was considerably down-regulated after SCF induction （both P < 0.05）. Conclusions The use of SCF can cause changes in the drug resistance of P. aeruginosa， induce multi-β-lactam antibiotics-resistant and even carbapenem-resistant P. aeruginosa. The increase of efflux pump MexCD-OprJ and the decrease of outer membrane porin OprD are the mechanisms underlying the role of SCF in the selection of P. aeruginosa. In clinical practice， physicians should be cautious about the use of SCF to reduce the occurrence of multidrug-resistant P. aeruginosa.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa;Cefoperazone-sulbactam;Multidrug resistance;

Carbapenem

由于抗菌藥物的不合理使用，使得多重耐藥菌的出現(xiàn)和傳播逐漸增加，嚴重威脅著人們的生命健康[1]。耐藥菌尤其是多重耐藥菌引起的各種感染已經(jīng)成為了一個重要的并且急需解決的公共衛(wèi)生問題。2017年中國細菌耐藥性監(jiān)測顯示，非發(fā)酵糖革蘭陰性菌的分離率達24%，其中銅綠假單胞菌占36%[2]。廣州某三甲醫(yī)院的流行病學研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的檢出率高達13%，僅次于鮑曼不動桿菌[3-4]。銅綠假單胞菌可引起各器官系統(tǒng)的急性感染，如肺部感染、血流感染等，還能長期定植在人體器官以及醫(yī)療器械表面，如皮膚傷口和尿管的定植，導致感染遷延不愈[5-6]。

頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（SCF）是一種具有抗銅綠假單胞菌活性的三代頭孢菌素，其對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌和大腸桿菌等革蘭陰性桿菌具有良好的抗菌活性。由于抗菌藥物的使用增加，銅綠假單胞菌的耐藥性正逐漸增加。根據(jù)2017年中國抗生素監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)中心調(diào)查顯示，銅綠假單胞菌對SCF、亞胺培南和美羅培南的耐藥性分別為24.8%、31.5%和26.3%[7]。在過去幾十年里，多重耐藥銅綠假單胞菌（MDRPA）的檢出率呈上升趨勢，在大部分地區(qū)其分離率達15% ～ 30%[8]。然而，關(guān)于SCF的使用是否會引起銅綠假單胞菌的耐藥譜增加，目前仍然缺乏實驗性研究。因此，本研究旨在通過體外誘導的方法，探討SCF是否會誘導MDRPA的產(chǎn)生并且初步探討其耐藥的機制。

材料與方法

一、臨床菌株收集

從2018年9月至2018年12月中山大學附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的呼吸道感染患者下呼吸道分泌物中收集4株對SCF和美羅培南均敏感的銅綠假單胞菌株，該4株均為氧化酶反應(yīng)陽性、革蘭染色陰性和具有典型的銅綠假單胞菌形態(tài)學表現(xiàn)。將4株細菌分為4組（A ～ D組），分別標記為A1、B1、C1和D1。以美國菌種保藏中心（ATCC）27853作為實驗標準株，分為S組，標記為S1。

二、體外誘導耐藥

將已報道的體外誘導方案經(jīng)過適當?shù)母牧己笥糜诒狙芯考毦T導[9]。用24孔板進行連續(xù)的抗菌藥物誘導，細菌暴露于比最低抑菌濃度（MIC）更高的抗菌藥物濃度中，每株誘導菌設(shè)置6個復孔，以最大化銅綠假單胞菌的生存率。3.2倍MIC（80%的4倍MIC）的SCF（頭孢哌酮鈉與舒巴坦鈉之比為2∶1）用于各菌株誘導。銅綠假單胞菌在同一濃度抗菌藥物暴露下連續(xù)培養(yǎng)50代（約8 d）。

從每株菌的M-H平板中挑取6個單克隆株，接種在1.5 ml LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)。每份過夜培養(yǎng)的菌液置于10%脫脂牛奶中-80 ℃保存。每株20 μl的菌液轉(zhuǎn)移到1.5 ml新鮮的含有3.2倍MIC SCF的LB液中，每24 h重復1次。一旦完成體外誘導，各菌株必須盡快保存于-80 ℃中。SCF誘導株標記為“s”。

三、藥物敏感性檢測

銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的敏感性用微量肉湯法進行檢測。常用抗菌藥物包括哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（TZP，哌拉西林鈉與他唑巴坦鈉之比為8∶1）、SCF（頭孢哌酮與舒巴坦之比為2∶1）、頭孢他啶他唑巴坦鈉（CTZ，頭孢他啶與他唑巴坦鈉之比為3∶1）、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星。采用2017年臨床與實驗室標準化所（CLSI）M100-S29指南作為評價銅綠假單胞菌的藥物敏感性標準。CLSI M100-S29指南上的藥物敏感性標準，對結(jié)果進行判讀。實驗室標準株ATCC27853用于抗生素質(zhì)量控制，其對各種藥物的MIC數(shù)值應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。所有試驗獨立重復3次。

四、總RNA提取和實時定量PCR（RT-qPCR）

每種菌株挑取單克隆菌落，在M-H平板中于37 ℃培育16 ～ 20 h。將一圈細菌用焦碳酸二乙酯（DEPC）水懸浮，13 000×g 離心3 min，棄上清，在冰上加入2 mg溶菌酶溶液孵育15 min，然后置于37 ℃的水浴中孵育10 min。最終懸浮液用于進行總RNA分離。應(yīng)用TaKaRa RNAiso Plus提取每種菌株的總RNA，然后使用TaKaRa PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser進行逆轉(zhuǎn)錄。使用TaKaRa TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ進行qRT-PCR。 所有引物均由廣州睿博興科生物公司合成，用于檢測mexB、mexD、mexF、mexY、OprD的表達，引物序列、產(chǎn)物長度和退火溫度見表1。用管家基因rpoD標準化上述mRNA的表達水平。

五、統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 7.04進行統(tǒng)計學分析。所有實驗均獨立重復3次，并取平均值作圖表示。采用幾何均數(shù)對不同組的同一類抗菌藥物的耐藥差異倍數(shù)進行統(tǒng)計分析。耐藥基因的表達變化采用表示。對不同基因表達中SCF誘導前和誘導后的菌株用兩獨立樣本t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、SCF誘導銅綠假單胞菌耐藥譜的變化

體外高濃度SCF誘導50代后，銅綠假單胞菌耐藥性發(fā)生明顯改變。誘導后的銅綠假單胞菌對抗菌藥物的MIC增加分別如下：①抗假單胞菌的β-內(nèi)酰胺+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類，TZP （2.0 ～ 64.0倍，平均14.0倍），SCF（4.0 ～ 32.0倍，平均14.0倍），CTZ（4.0 ～ 64.0倍，平均14.0倍）;②抗假單胞菌的頭孢菌素類，頭孢他啶（2.0 ～ 32.0倍，平均9.0倍），頭孢吡肟（0.5 ～ 256.0倍，平均16.0倍）;③抗假單胞菌的碳青霉烯類，亞胺培南（0.5 ～ 2.0倍，平均1.0倍），美羅培南（4.0 ～ 16.0倍，平均5.0倍）;④單環(huán)β-內(nèi)酰胺類，氨曲南（1.0 ～ 32.0倍，平均6.0倍）;⑤抗假單胞菌的喹諾酮類，環(huán)丙沙星（1.0 ～ 4.0倍，平均1.0倍），左氧氟沙星（0.5 ～ 4.0倍，平均1.0倍）;⑥氨基糖苷類，慶大霉素（0.5 ～ 2.0倍，平均1.0倍），阿米卡星（0.5 ～ 1.0倍，平均0.7倍），見表2。ATCC27853對所有抗菌藥物的敏感性均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

二、SCF誘導銅綠假單胞菌外排泵和孔道蛋白的表達水平變化

除B組外大部分SCF誘導株中mexD升高，除S組外大部分SCF誘導株中OprD降低，mexB和mexY也存在升高的趨勢，5組中有2組mexB升高，2組mexY升高（P均< 0.05），但是mexF的表達沒有升高趨勢（P > 0.05），見圖1。

討論

SCF是β-內(nèi)酰胺類+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復合抗菌藥物，屬于第三代頭孢菌素，其抗菌機制主要是抑制細菌細胞壁的合成。作為第一代β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，舒巴坦鈉滅活多種A類β-內(nèi)酰胺酶，從而協(xié)同增強頭孢哌酮鈉的抗菌作用，但是對B類、C類以及D類β-內(nèi)酰胺酶的水解作用比較差[10]。其對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性以及對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌和大腸桿菌等革蘭陰性桿菌有良好的抗菌活性，SCF可用于治療革蘭陰性桿菌引起的醫(yī)院獲得性肺炎、呼吸機相關(guān)肺炎、支氣管擴張以及膿毒血癥等，因而在臨床上得到廣泛使用。

由于SCF在治療上過度使用，使得其耐藥性逐漸增加。已有研究表明MDRPA的產(chǎn)生與臨床抗銅綠假單胞菌抗菌藥物的使用有關(guān)，主要包括喹諾酮類和碳青霉烯類抗菌藥物[11-12]。Raman等[13]報道臨床上使用喹諾酮類和碳青霉烯類抗菌藥物可以分別增加3.34倍和12.68倍產(chǎn)生MDRPA的風險（與敏感的銅綠假單胞菌相比）。然而，SCF的使用是否與MDRPA的產(chǎn)生有關(guān)尚不明確。

本研究使用體外連續(xù)誘導方案評估在SCF誘導壓力下銅綠假單胞菌所出現(xiàn)的進化突變。使用3.2倍MIC進行誘導可以降低細菌生長率至20%，同時保證細菌在高濃度抗菌藥物暴露下仍可以繼續(xù)生長，達到更好地模擬臨床體內(nèi)抗菌藥物誘導耐藥的目的。根據(jù)CLSI M100指南的質(zhì)控標準，ATCC27853對SCF等12種抗菌藥物的MIC均在指定范圍之內(nèi)，說明了后續(xù)的藥物敏感性實驗具有可靠性。結(jié)果顯示，體外給予SCF可誘導出對多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥的銅綠假單胞菌，包括抗假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（哌拉西林/他唑巴坦、SCF、頭孢他啶/他唑巴坦）、抗銅綠假單胞菌的頭孢菌素（頭孢他啶、頭孢吡肟）、抗銅綠假單胞菌的碳青霉烯類（亞胺培南、美羅培南）以及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類（氨曲南）。其中對頭孢吡肟的MIC平均增加倍數(shù)最高，可達16.0倍。對抗假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗菌藥物的MIC平均增加14.0倍。按照文獻報道的細菌耐藥分類標準，可認為SCF體外誘導可以產(chǎn)生MDRPA[14]。已有研究表明三代頭孢菌素或者抗銅綠假單胞菌頭孢菌素的使用與耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的產(chǎn)生沒有關(guān)系[15-18]。然而，本研究中SCF確實能誘導耐碳青霉烯銅綠假單胞菌。體外給予高濃度SCF可以升高銅綠假單胞菌對美羅培南的MIC至少4.0倍，而對于亞胺培南的MIC影響卻不明顯。本研究結(jié)果與此前的研究相符，即耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的流行與臨床使用頭孢菌素和碳青霉烯類有關(guān)[19-20]。

不同外排泵對不同抗菌藥物有不同的轉(zhuǎn)運能力。本研究分析到外排泵mexD和孔道蛋白OprD在SCF誘導耐藥中起重要作用。MexCD-OprJ主要轉(zhuǎn)運喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素、氯霉素、頭孢菌素（除了頭孢他啶）以及美羅培南等抗菌藥物[21]。銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性與MexAB-OprM和MexXY-OprM耐藥關(guān)系最密切，其次是MexEF-OprN，與MexCD-OprJ關(guān)聯(lián)性比較低[22]。已有研究表明孔道蛋白OprD的表達降低或者缺失可以增加銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性[23]。這些研究與本研究的結(jié)果相符。MexEF-OprN與SCF誘導所致的耐藥無關(guān)。至于MexAB-OprM和MexXY-OprM對于SCF所致耐藥的影響仍不明確，需要進一步研究。

綜上所述，隨著三代頭孢菌素在革蘭陰性桿菌感染疾病中的廣泛使用，特別是SCF，革蘭陰性桿菌對頭孢菌素類抗菌藥物的耐藥性大大增加。在SCF使用壓力下，敏感的銅綠假單胞菌可被誘導成MDRPA，甚至是耐碳青霉烯銅綠假單胞菌。外排泵MexD的升高和孔道蛋白OprD的降低是體外SCF誘導銅綠假單胞菌耐藥的重要機制。因此，在臨床上，除了盡量減少對碳青霉烯類抗菌藥物的使用外，我們同時也要有效控制對三代頭孢菌素的依賴，制定更為安全合理的抗菌藥物使用方案，從而進一步防止MDRPA或者耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)。

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（收稿日期：2019-11-20）

（本文編輯：林燕薇）