顏春魯， 安方玉， 汪永鋒， 金 華， 趙崇博， 王統(tǒng)香， 鄧 婕， 張蕾蕾

((1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 2. 教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心， 3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 4. 中醫(yī)臨床學(xué)院， 5. 臨床醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州730000； 6. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000； 7. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000； 8. 蘭州市疾病預(yù)防控制中心， 甘肅 蘭州 730000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是以膝關(guān)節(jié)軟骨變性、丟失、膝關(guān)節(jié)邊緣軟骨和軟骨下骨病變?yōu)橹鞯囊环N慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，臨床表現(xiàn)以膝關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)障礙為主[1]。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)[2]，在超過55 歲的中老群體中，KOA的發(fā)病率約達(dá)到44%～70%。近年來，隨著社會(huì)老齡化人口的增加，其發(fā)病率也顯著上升，成為危害著中老年人健康的重要隱患，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，引起全社會(huì)的極大關(guān)注。目前 KOA 的治療仍然以西醫(yī)治療為主，但是西藥毒副作用較大、且無法從根本上解決關(guān)節(jié)軟骨退變問題。近年來，中藥則以低毒、安全、高效的優(yōu)勢(shì)廣泛用于治療KOA，其對(duì)KOA的治療機(jī)制研究備受關(guān)注。有研究證實(shí)，補(bǔ)腎活血方通過減少炎癥因子的產(chǎn)生來保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨組織，對(duì)治療KOA確實(shí)有效[3]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)[4]，補(bǔ)腎中藥右歸丸也可以通過減少KOA模型鼠炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生來對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織損傷發(fā)揮治療作用。但是，右歸丸除了抑制炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生外，是否還可以通過調(diào)節(jié)其他一些蛋白的表達(dá)來發(fā)揮治療作用，這些蛋白通過什么分子機(jī)制發(fā)揮作用尚不十分清楚。為此，本研究以SD作為研究對(duì)象，采用Hulth法建立KOA 大鼠模型，給予右歸丸干預(yù)，檢測(cè)大鼠軟骨組織骨誘導(dǎo)因子(osteoglycin，OGN)、骨黏連蛋白(osteonectin，ON)、纖維蛋白原2(fibrinogen 2，F(xiàn)BN2)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)蛋白表達(dá)變化，探討右歸丸治療 KOA 的效應(yīng)及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體重(180±20)g，購自我?？蒲袑?shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。

1.2 主要試劑

水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20150105)；GAPDH抗體(Immuno Way，批號(hào)：B4501)； Rabit Anti-OGN Polyclonal Antibody(Bioss，批號(hào)：AD04145689)；Rabit Anti-ON Polyclonal Antibody(Bioss，批號(hào)：AB10115689)；Rabit Anti-FBN2 Polyclonal Antibody(Bioss，批號(hào)：AG09111831)；Rabit Anti-GSK-3β Polyclonal Antibody(Immuno Way，批號(hào)：B1801)。

1.3 主要儀器

BioMATE 3S型蛋白、核酸濃度測(cè)定儀(Thermo公司)； BX53型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(凱達(dá)集團(tuán)成員高科技公司)；OSE-Y10型電動(dòng)組織研磨器(上海Tiangen 公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物及給藥劑量

右歸丸(仲景宛西制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z41022170，批號(hào)：151108)，人的臨床用量為：27 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法：27 g×0.018×5≈2.4 g/kg，作為中劑量。則右歸丸高、中、低劑量分別為4.8、2.4、1.2 g/kg；硫酸氨基葡萄糖片(保節(jié)力，新興同仁藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041317，批號(hào)：160302)；青霉素(北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H13020657，批號(hào)：F6042103)。

1.5 動(dòng)物分組、造模及給藥

60只 SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、硫酸氨基葡萄糖組、右歸丸高、中、低劑量組，每組10只。 模型組及干預(yù)組采用改良Hulth 方法復(fù)制KOA模型[5-6]。假手術(shù)組 SD 大鼠從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)只打開關(guān)節(jié)腔，不破壞韌帶和半月板，并保留關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后給予青霉素(20萬 U/d)肌肉注射，連續(xù)3 d。各組大鼠自由飲水，攝食6 周后，HE染色觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化以判定模型制備是否成功，造模成功后藥物組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，硫酸氨基葡萄糖組灌服硫酸氨基葡萄糖(0.17 g/kg)，右歸丸高、中、低劑量組分別按 4.8、2.4、1.2 g/kg灌服相應(yīng)的藥物，干預(yù) 8周。股動(dòng)脈采血處死各組動(dòng)物，摘取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)固定于4%多聚甲醛，右側(cè)膝關(guān)節(jié)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 HE染色觀察軟骨形態(tài)學(xué)變化

采用保留股骨遠(yuǎn)端1/4和脛骨端近端1/4的方法留取完整膝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定左側(cè)膝關(guān)節(jié)24 h后10% EDTA-Na2脫鈣8周，石蠟包埋制作蠟塊、切片HE 染色觀察軟骨病理形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行 Mankin 評(píng)分方法[7]進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：軟骨結(jié)構(gòu)如常，軟骨細(xì)胞數(shù)量如常，基質(zhì)染色正常，潮線比較完整記為0 分；軟骨表面有不規(guī)則裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色減退，出現(xiàn)多重潮線記為1 分；軟骨裂隙深達(dá)肌層，軟骨細(xì)胞成簇生長，基質(zhì)染色明顯減退，軟骨下血管浸入肌層記為2分；軟骨裂隙深達(dá)輻射層，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，基質(zhì)染色明顯減退記為3 分；軟骨裂隙深達(dá)鈣化層，基質(zhì)染色完全消失記為4 分；軟骨層脫落記為5 分。

1.7 免疫組化法觀察軟骨組織OGN、ON和FBN2的蛋白表達(dá)

4%多聚甲醛固定膝關(guān)節(jié)軟骨并脫鈣，將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水后放在切片放入配制好的枸櫞酸緩沖液盒中進(jìn)行微波修復(fù)；3%H2O2室溫孵育30 min； 5%山羊血清封閉 30 min；滴加50 μl 的OGN、ON和FBN2 Polyclonal Antibody(一抗的稀釋濃度分別為： 1∶100、1∶200、1∶100)，同時(shí)用PBS 緩沖液代替一抗設(shè)立陰性對(duì)照，將切片放入濕盒中，4℃過夜；滴加山羊抗兔的二抗，室溫下放置30 min；滴加ABC工作液，37℃孵育60 min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；二甲苯透明，封固。染色以軟骨基質(zhì)表層和中層的軟骨細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，由我校病理教研室老師采用雙盲法進(jìn)行閱片。應(yīng)用美國 Image-Pro Plus 6.0 全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)軟骨細(xì)胞陽性染色的積分光密度( integral optical density，IOD) 進(jìn)行定量分析，對(duì)進(jìn)行標(biāo)記，以其中一個(gè)具有代表意義陽性結(jié)果的視野的棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)檢測(cè)所有視野的陽性結(jié)果。鑒于經(jīng)費(fèi)的限制，加上大鼠動(dòng)物數(shù)量6只及以上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本實(shí)驗(yàn)在免疫組化的分析中每組采用的動(dòng)物數(shù)量均是6只。

1.8 Western blot法測(cè)定軟骨組織GSK-3β的蛋白表達(dá)

軟骨組織蛋白質(zhì)的提取用 RIPA 裂解液，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用BCA 法，并調(diào)整點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)濃度為50 μg /10 μl，10 μl/well，作SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加抗Rabit Anti-GSK-3β Polyclonal Antibody一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后滴加山羊抗兔IgG二抗孵育，室溫 孵育2 h，ECL超敏發(fā)光液顯色曝光。應(yīng)用美國 Image J分析軟件以GAPDH抗體作為內(nèi)參進(jìn)行灰度值分析。鑒于經(jīng)費(fèi)的限制，加上大鼠動(dòng)物數(shù)量6只及以上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本實(shí)驗(yàn)在Western blot的分析中每組采用的動(dòng)物數(shù)量均是6只。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 右歸丸對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)影響

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞呈水平排列，關(guān)節(jié)軟骨邊緣光滑；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨邊緣嚴(yán)重破壞，軟骨細(xì)胞排列紊亂；右歸丸低、中劑量組關(guān)節(jié)軟骨邊緣不平整，軟骨細(xì)胞排列紊亂； 右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞分布偶見不均，關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑。Mankin評(píng)分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Mankin評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評(píng)分均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量組大鼠Mankin評(píng)分均顯著升高(P< 0.05或P<0.01，表1，圖1)。

Fig. 1 The pathomorphological changes of articular cartilages(HE ×200)

2.2 右歸丸對(duì)大鼠軟骨組織OGN、ON和FBN2蛋白表達(dá)的影響

染色以軟骨基質(zhì)表層和中層的軟骨細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。假手術(shù)組 OGN和ON均呈陽性表達(dá)，F(xiàn)BN2呈弱陽性表達(dá)。模型組關(guān)節(jié)軟骨中OGN和ON均幾乎無表達(dá)，F(xiàn)BN2強(qiáng)陽性表達(dá)。右歸丸中、高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組OGN和ON呈陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組FBN2弱陽性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠OGN和ON蛋白表達(dá)IOD值顯著降低，F(xiàn)BN2蛋白表達(dá)IOD值顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸中、高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組OGN和ON蛋白表達(dá)IOD值均顯著升高，而右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組FBN2蛋白表達(dá)IOD值顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低劑量組OGN蛋白表達(dá)IOD值明顯降低，低、中劑量組ON蛋白表達(dá)IOD值也均明顯降低，而右歸丸低、中劑量組FBN2蛋白表達(dá)IOD值均明顯升高(P<0.05或P<0.01，表2，圖2-4)。

Tab. 1 Comparison of Mankin scores in each n=10)

Tab. 2 IOD value comparison of the protein expressions of OGN, ON and FBN2 in each n=6)

Fig. 2 OGN protein expression of articular cartilage tissue in each group(IHC ×200)

Fig. 3 ON protein expression of articular cartilage tissue in each group(IHC ×200)

Fig. 4 FBN2 protein expression of articular cartilage tissue in each group(IHC ×200)

2.3 右歸丸對(duì)大鼠軟骨組織GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織GSK-3β蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖干預(yù)組GSK-3β的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量組GSK-3β的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01，表3，圖5)。

3 討論

右歸丸出自《景岳全書》，方藥組成為：熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當(dāng)歸。方中附子、肉桂、鹿角膠為君藥，具有培補(bǔ)腎中元陽，溫里祛寒之功效；熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥為臣藥，具有滋陰益腎，養(yǎng)肝補(bǔ)脾，填精補(bǔ)髓之功效。菟絲子、杜仲為佐藥，兼具補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝之功效，再配以當(dāng)歸養(yǎng)血和血，共補(bǔ)肝腎精血。諸藥合用，以溫腎陽為主而陰陽兼顧，肝脾腎并補(bǔ)，以在陰中求陽為其特點(diǎn)，使元陽得以歸原。KOA的中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)“肝腎虧虛為本，氣滯、血瘀、痰濕凝聚為標(biāo)”，并已有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血中藥可顯著改善 KOA大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹、軟骨形態(tài)和軟骨退變，說明補(bǔ)腎活血中藥治療 KOA可能有效[8]。此外，作為補(bǔ)腎的經(jīng)典方藥右歸丸近年來也逐漸應(yīng)用于臨床膝骨關(guān)節(jié)炎患者的治療，并主要用于治療陽虛寒凝型膝骨關(guān)節(jié)炎患者，能夠有效改善患者的炎癥癥狀和緩解疼痛，增強(qiáng)患者的免疫力[9-10]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞呈水平排列，關(guān)節(jié)軟骨邊緣光滑；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨邊緣嚴(yán)重破壞，軟骨細(xì)胞排列紊亂；給予右歸丸干預(yù)后，右歸丸低、中劑量組關(guān)節(jié)軟骨邊緣不平整，軟骨細(xì)胞排列紊亂； 右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞分布偶見不均，關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑。說明右歸丸治療KOA有效，但具體機(jī)制不明。

Tab. 3 Effect of Youguiwan on the protein expressions of GSK-3β in KOA n=6)

Fig. 5 GSK-3β protein expressions of cartilaginous tissue in each group

骨誘導(dǎo)因子(osteoglycin，OGN)是一種屬于富含亮氨酸小分子蛋白多糖基因家族(small leucine-rich proteoglycan，SLRP)成員的細(xì)胞外基質(zhì)分子蛋白。研究表明[11-14]，OGN參與膠原纖維的形成和細(xì)胞的生長分化。葉青青等人[15]的研究發(fā)現(xiàn)，OGN的過度表達(dá)上調(diào)成骨相關(guān)標(biāo)志物ALP的表達(dá)，并且下調(diào)脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)記物aP2的表達(dá)和破骨細(xì)胞分化因子RANKL基因的表達(dá)，以促進(jìn)mMSCs成骨分化和抑制破骨細(xì)胞的作用。另有研究也發(fā)現(xiàn)，OGN可阻斷OA患者的分解代謝途徑和促血管生成途徑[16]，也參與KOA軟骨組織的重構(gòu)[17-18]?？梢?，OGN對(duì)成骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞的分化起到重要的調(diào)節(jié)作用。骨粘連蛋白(osteonectin，ON) 是另外一種與Ⅰ型膠原形成非可溶性復(fù)合物，具有促進(jìn)骨的鈣化、骨形成和骨重建的細(xì)胞外基質(zhì)非膠原蛋白的作用。研究發(fā)現(xiàn)，骨組織中的骨粘連蛋可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞來促進(jìn)骨的生長[19]。纖維蛋白原2(fibrinogen 2 ，F(xiàn)BN2)是一種參與凝血反應(yīng)的蛋白質(zhì)，迄今為止，在KOA中的作用鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠軟骨組織OGN、ON的蛋白表達(dá)明顯降低，F(xiàn)BN2的蛋白表達(dá)明顯升高；給予右歸丸干預(yù)后，其KOA模型鼠軟骨組織OGN、ON的蛋白表達(dá)明顯升高，F(xiàn)BN2的蛋白表達(dá)明顯降低。說明右歸丸可能通過促進(jìn)骨形成和骨重構(gòu)來延緩KOA模型鼠的關(guān)節(jié)軟骨退變，對(duì)KOA具有保護(hù)作用。而KOA模型鼠是否存在凝血功能異常及右歸丸對(duì)KOA模型鼠的凝血功能是否存在調(diào)控作用，單憑FBN2的蛋白表達(dá)尚不能解釋，尚需要通過其他凝血因子的檢測(cè)來深入研究。

糖原合成酶激酶--3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是胞液中抑制Wnt信號(hào)通路異常激活的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。Wu等[20]在用IL-1β誘導(dǎo)的兔關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，Wnt1 和 β-catenin 的表達(dá)是增高的， GSK-3β 表達(dá)水平是降低的。Zheng等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，用補(bǔ)骨脂提取物Psoralen(PSO)干預(yù)正常SD大鼠軟骨細(xì)胞， PSO能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞Wnt-4和β-catenin等蛋白的表達(dá)，抑制了GSK-3β的蛋白表達(dá)；而Litherland等[22]在KOA模型鼠和IL-β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，用GSK-3β抑制劑治療的模型鼠與假手術(shù)比較，軟骨破壞嚴(yán)重，并在軟骨組織中出現(xiàn)了膠原蛋白的高表達(dá)；本研究結(jié)果顯示，KOA模型鼠GSK -3β的蛋白表達(dá)是降低的，而右歸丸治療組GSK-3β的蛋白表達(dá)是升高的，與上述研究結(jié)果一致。說明右歸丸可能通過增強(qiáng)GSK-3β的表達(dá)來抑制Wnt信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療作用。但是GSK-3β在KOA發(fā)病機(jī)制中的哪個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用的問題，還需要進(jìn)一步深入研究。

以往膝骨關(guān)節(jié)炎的研究主要集中于炎癥反應(yīng)及凋亡調(diào)控等機(jī)制的研究[23-24]，本研究結(jié)果則從影響膝骨關(guān)節(jié)炎模型鼠骨形成和骨分化的調(diào)控蛋白OGN和ON的表達(dá)變化初步揭示了右歸丸治療KOA的機(jī)制，其可能機(jī)制是通過促進(jìn)OGN和ON的蛋白表達(dá)來促進(jìn)KOA模型鼠的骨形成和骨重建，以及抑制GSK-3β的蛋白表達(dá)來抑制Wnt信號(hào)通路的激活，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨組織的退變。動(dòng)態(tài)檢測(cè)KOA患者OGN和ON的表達(dá)水平也可能成為未來中藥復(fù)方治療KOA療效靶點(diǎn)的篩選依據(jù)。