楚美云 張林尚 婁文勇 宗敏華 唐語謙, 徐曉飛 楊繼國,

(1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2. 華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808)

渾濁紅球菌PD630擁有高脂質(zhì)產(chǎn)量[1-2]，適合于高細(xì)胞密度的方式來進(jìn)行培養(yǎng)，并且可以代謝多種碳源[3-4]。該菌是用于工業(yè)生產(chǎn)微生物油脂極具潛力的菌株之一[5]，其基因組信息已被公布，遺傳改造體系也已建立。渾濁紅球菌PD630可以將醇類作為其碳源實(shí)現(xiàn)油脂的合成[6]，合成的油脂在醫(yī)療、保健領(lǐng)域以及生物能源領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用前景[7-8]。

一般而言，自然條件下油脂中偶數(shù)碳脂肪酸的含量比較高，奇數(shù)碳脂肪酸的含量低。而近些年的一些報(bào)道顯示奇數(shù)碳脂肪酸具有重要的功能特性。奇數(shù)碳脂肪酸可用作抗過敏、抗炎和抗真菌劑[9]。奇數(shù)碳脂肪酸在人體健康中也起著重要作用[10]。有文獻(xiàn)[11]報(bào)道正丙醇的添加對于提高渾濁紅球菌PD630中奇數(shù)碳脂肪酸的含量至關(guān)重要。然而，對于微生物而言，醇類可能會(huì)對其產(chǎn)生一定的毒害作用。比如對其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生破壞作用，進(jìn)而使得胞內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生外泄，原因是醇能改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性并破壞磷脂層[12]。此外，許多生理功能，包括營養(yǎng)物和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞代謝都會(huì)受到醇的影響[13]。目前正丙醇對紅球菌PD630的毒害作用尚不清楚，紅球菌在正丙醇存在時(shí)的應(yīng)激機(jī)制尚不明確。

UPLC-Triple-TOF/MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析可以通過檢測微生物在經(jīng)受外部刺激前后，其體內(nèi)小分子代謝物的變化進(jìn)而闡明微生物對外界刺激的應(yīng)激機(jī)制。紅球菌在正丙醇存在時(shí)的應(yīng)激機(jī)制還未見研究。試驗(yàn)擬采用UPLC-Triple-TOF/MS對正丙醇存在條件下渾濁紅球菌PD630體內(nèi)的代謝物進(jìn)行非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，并結(jié)合主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)對其進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析、識別差異代謝物，分析短肽、磷脂和丙酰輔酶A(CoA)等代謝物的變化以探究渾濁紅球菌PD630對正丙醇的應(yīng)激機(jī)制；同時(shí)采用氣相色譜儀測定脂肪酸的變化，為后續(xù)的深入研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

渾濁紅球菌PD630(RhodococcusopacusPD630, DSMZ44193)：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。菌種保藏于體積濃度為25%的甘油溶液中，-80 ℃冰箱凍存。

1.2 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋：SQ510C型，廣州科朋科學(xué)儀器有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：ZQLY-180S型，上海知楚儀器有限公司；

醫(yī)用型潔凈工作臺：AIRTECH SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010PlusAF型，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；

超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：TripleTOF?6600型， 美國AB Sciex公司；

-80 ℃超低溫冰箱：DW-86L578J型，廣州科曉科學(xué)儀器有限公司。

1.3 主要培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基配方：牛肉膏粉3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，最終pH 7.4±0.2，250 mL三角瓶，裝液量為50 mL；

對照組發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖12 g/L，KH2PO41.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，尿素0.6 g/L，F(xiàn)eNaEDTA 5 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 20 mg/L，MnCl2·4H2O 0.05 mg/L，CoCl2·6H2O 0.2 mg/L，H3BO30.3 mg/L，Na2MoO4·2H2O 2 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.1 mg/L，NiCl2·6H2O 0.02 mg/L，CuCl2·2H2O 0.01 mg/L[14-15]；

試驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)基配方：在對照組發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加體積分?jǐn)?shù)1%正丙醇；

配置后裝入250 mL三角瓶，裝液量為100 mL。其中對照組和試驗(yàn)組每組6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以上培養(yǎng)基均在121 ℃，20 min條件下滅菌，冷卻備用。

1.4 培養(yǎng)方法

(1) 種子培養(yǎng)：將菌種接入上述種子培養(yǎng)基，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，即為種子液。

(2) 發(fā)酵培養(yǎng)：接種量1%，培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速分別為30 ℃、160 r/min。分別在48 h(對應(yīng)于指數(shù)期)和72 h(對應(yīng)于穩(wěn)定期)取樣，液氮淬滅，并置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 GC測定脂肪酸

發(fā)酵培養(yǎng)84 h后，收集菌體、破壁提油。具體步驟：稱取1 g濕菌體置于10 mL提脂瓶中，加入4 mL 3 mol/L鹽酸、2 mL正己烷，振蕩30 s充分混勻；然后沸水浴煮5 min，邊煮邊振蕩；冷卻至室溫，離心(5 000×g，5 min)，收集正己烷層(上層)[16]。再對試樣進(jìn)行甲酯化[17]，分析脂肪酸組成。色譜柱為HP-88(100 m×0.32 mm，0.22 μm)，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度270 ℃，汽化室溫度250 ℃，分流比20∶1，進(jìn)樣體積2 μL，載氣N2。程序升溫設(shè)置：180 ℃保持5 min，以2 ℃/min 的速度提高到220 ℃，保持20 min[18]。以37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定性分析，由相對質(zhì)量校正因子來修正的峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算脂肪酸的含量。

1.6 UPLC-MS分析

使用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Triple-TOF/MS)對樣品進(jìn)行分析。色譜柱：Waters UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相A為體積比1∶1乙腈—異丙醇溶液(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為水(含0.1%甲酸)。梯度洗脫，洗脫程序：0 min，5% A；3 min，20% A；9 min，95% A；13 min，95% A；14 min，5% A；16 min，5% A。柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。質(zhì)譜條件：離子源溫度120 ℃；載氣流量900 L/h；電噴霧毛細(xì)管電壓1.0 kV；進(jìn)樣電壓40 V；質(zhì)譜掃描范圍(m/z)50～1 000；分辨率30 000[11]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將UPLC-Triple-TOF/MS獲得的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。然后將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入ropls軟件(Version1.6.2)中進(jìn)行處理，并在Majorbio I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com)對數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA以及OPLS-DA分析。同時(shí)在Majorbio I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com)結(jié)合OPLS-DA模型的VIP值≥1和P值≤0.05確定樣品之間的顯著差異代謝物[19]。

原始數(shù)據(jù)用代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI 進(jìn)行搜庫鑒定，將一級質(zhì)譜(MS)和二級質(zhì)譜(MS/MS)信息與代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配。其中主要數(shù)據(jù)庫為https://metlin.scripps.edu/；http://www.hmdb.ca/等公共數(shù)據(jù)庫以及Majorbio I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com)的自建數(shù)據(jù)庫。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，每組重復(fù)3次。P值<0.05時(shí)，認(rèn)為是具有顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸組成

為了進(jìn)一步印證正丙醇能夠提高渾濁紅球菌PD630所產(chǎn)油脂中奇數(shù)碳脂肪酸的百分含量，分析了體積分?jǐn)?shù)1%正丙醇添加量下菌油的脂肪酸組成，結(jié)果見表1。正丙醇的添加對油脂的脂肪酸含量影響較大。體積分?jǐn)?shù)1%正丙醇使奇數(shù)碳脂肪酸的含量從32.91%提高至79.66%，提升了46.75%。主要的奇數(shù)碳脂肪酸為C15:0(38.42%)、C17:0(17.56%)和C17:1(23.68%)。Zhang等[11]研究表明向培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)0.5%～1.5%正丙醇，奇數(shù)碳脂肪酸的含量提高了46.7%～55.1%，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 代謝組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

PCA分析結(jié)果(圖1)表明在48 h和72 h試驗(yàn)組和對照組樣本在整體分布上有分離趨勢，但兩個(gè)主成分對X累積解釋率分別為0.650和0.608，表明PCA模型的穩(wěn)定性不夠高。主要原因是PCA是一種無監(jiān)督的模式，其分類判別能力還不夠強(qiáng)。

為了獲得更好的分離模型，采用OPLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，48 h時(shí)，模型對X矩陣?yán)鄯e解釋率為0.780，對Y矩陣的累積解釋率為0.991，模型預(yù)測能力良好(0.978)。72 h樣本，3個(gè)模型的參數(shù)分別為0.727，0.995，0.986，表明模型質(zhì)量較好，模型具有良好的可靠性和預(yù)測性。此外，由圖2可知，試驗(yàn)組和對照組明顯分開，模型良好。

2.3 差異代謝物

由于OPLS-DA模型優(yōu)于PCA方法分析的結(jié)果，故使用OPLS-DA模型對差異代謝物進(jìn)行分析，其熱圖見圖3。48 h的樣本中，試驗(yàn)組與對照組的差異代謝物共有54種；72 h的樣本中，試驗(yàn)組與對照組的差異代謝物有61種。在眾多的差異代謝物中，短肽和磷脂的變化最為突出。此外，丙酰CoA也發(fā)生了顯著變化。因此，重點(diǎn)分析這3類化合物。

表1 正丙醇對渾濁紅球菌PD630脂肪酸組成的影響Table 1 Effect of 1-propanol on the fatty acid profiles produced by Rhodococcus opacus PD630 %

圖1 試驗(yàn)組和對照組各樣品在48 h和72 h的主成分分析(PCA)Figure 1 Principal component analysis (PCA) for the samples between test and control at 48 and 72 h

圖2 試驗(yàn)組和對照組各樣品在48 h和72 h的正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)Figure 2 Orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) for the samples between test and control at 48 and 72 h

在添加正丙醇后，菌體代謝物中短肽的豐度顯著下降，豐度下降的短肽主要有：Gamma-Glu-Leu、Glu-Val、Glu-Met、Glu-Tyr、Glu-Trp。這些短肽均含有谷氨酸殘基，谷氨酸殘基是重要的鮮味物質(zhì)。同時(shí)谷氨酸是已知的滲透保護(hù)劑，醇存在時(shí)，能夠起到保護(hù)作用[20-21]。

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實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)渾濁紅球菌PD630時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的后期有風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，推測與這些短肽有關(guān)。這些短肽可能是紅球菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)生的信號分子。另外，短肽是氨基酸合成和分解的中間代謝產(chǎn)物，短肽的進(jìn)一步降解生成氨基酸，進(jìn)而進(jìn)入氨基酸代謝途徑。而氨基酸代謝對于提高菌對醇的耐受性至關(guān)重要[22]。此外，短肽降解的增加在一定程度上防止了蛋白質(zhì)在溶劑激發(fā)下蛋白質(zhì)聚集或錯(cuò)誤折疊[23-24]。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)添加丙醇時(shí)二肽的含量顯著下降，一方面可能是正丙醇抑制了某些酶，導(dǎo)致二肽信號分子的含量降低。另一方面，可能是菌啟動(dòng)了自身的應(yīng)激機(jī)制，加速了蛋白質(zhì)的代謝，進(jìn)而提高自身對正丙醇的耐受性。

菌體代謝物中磷脂分子的不飽和度增加顯著。由于磷脂是膜的主要結(jié)構(gòu)組分，對細(xì)胞的活力至關(guān)重要[25]，所以對磷脂的變化進(jìn)行了研究。通過對磷脂上脂肪酸的不飽和度進(jìn)行分析，圖4表明在正丙醇存在條件下磷脂分子的不飽和度增加，間接說明細(xì)胞膜的不飽和度增加。在長期暴露于醇中會(huì)改變膜中存在的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例，這種效應(yīng)主要取決于所用溶劑的碳鏈長度[26]。例如文獻(xiàn)[27]中報(bào)道，短鏈(C2～C4)烷醇存在時(shí)，菌會(huì)增加細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸濃度。然而，長鏈(C5～C9)烷醇會(huì)增加其飽和脂肪酸的含量[27]。菌是通過增加不飽和脂肪酸的濃度來保護(hù)膜功能，以最小化溶劑對雙層結(jié)構(gòu)的影響，或通過增加飽和脂肪酸以恢復(fù)膜中的順序[27-28]。由于有機(jī)溶劑會(huì)使得膜的流動(dòng)性發(fā)生改變，并且引起磷脂雙層的穩(wěn)定性降低，因此細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)通過改變磷脂的生物合成速率和組成來補(bǔ)償這種情況。此外，不同的菌暴露在不同有機(jī)溶劑中所產(chǎn)生的應(yīng)激機(jī)制是不同的。Henderson等[25]通過脂質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)酵母通過改變脂質(zhì)組成來減輕乙醇的脅迫作用。而Nielsen等[29]發(fā)現(xiàn)溶血性葡萄球菌和芽孢桿菌ORAs2是通過增加膜流動(dòng)性來適應(yīng)溶劑挑戰(zhàn)。

菌體代謝物中丙酰CoA的豐度上升顯著。丙酰CoA是產(chǎn)生奇數(shù)碳脂肪酸的關(guān)鍵中間體，因?yàn)楹铣善鏀?shù)碳脂肪酸的主要起始底物是丙酰CoA。由圖5可知，正丙醇的加入使得丙酰CoA的豐度增加。以二碳單位的形式來對脂肪酸鏈進(jìn)行延長是脂肪酸合成的方式。當(dāng)以丙酰CoA為起始底物每經(jīng)一個(gè)循環(huán)延伸兩個(gè)碳原子單元，所以最終生成的脂肪酸為奇數(shù)碳脂肪酸。例如在丙酰CoA的基礎(chǔ)上經(jīng)過6或7個(gè)循環(huán)時(shí)，最終分別產(chǎn)生C15:0和C17:0[30-31]。所以由丙酰CoA的豐度增加可以推斷奇數(shù)碳脂肪酸的合成將增加，與表1中脂肪酸的結(jié)果相吻合。表明正丙醇是通過影響丙酰CoA的豐度進(jìn)而影響奇數(shù)碳脂肪酸的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

采用UPLC-Triple-TOF/MS測定代謝物的變化，探究了紅球菌PD630在正丙醇存在時(shí)的應(yīng)激機(jī)制。并且運(yùn)用氣相色譜對添加正丙醇的菌油的脂肪酸組成及含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：應(yīng)激機(jī)制主要表現(xiàn)在短肽減少、細(xì)胞膜磷脂的不飽和度增加且丙酰CoA出現(xiàn)顯著性的增加；奇數(shù)碳脂肪酸的含量從32.91%提高到79.66%。但試驗(yàn)仍然還存在著一些問題有待解決，如在基因水平上解釋該應(yīng)激機(jī)制。

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