汪沁，齊嘉欣，溫金熙，周興平

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

近年來(lái)，上轉(zhuǎn)換熒光材料由于具有新穎的光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，其合成研究引起了廣泛的關(guān)注[1-2]。氧化釔（Y2O3）是一種很有前途的上轉(zhuǎn)換材基質(zhì)，其在摻入Yb3+和Er3+離子后，可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光性質(zhì)。制備這種材料的方法多種多樣，包括溶膠-凝膠法[3]、固相法[4]、共沉淀法[5]、水熱法[6]和燃燒法[7]。一般情況下，使用水熱法進(jìn)行制備，再煅燒生成產(chǎn)物。但是，Y2O3納米材料還存在一些有待解決的問(wèn)題，如制備時(shí)所需的煅燒溫度較高[8]、由氫氧化物制備氧化物的情況居多[9-10]、會(huì)使反應(yīng)物有殘留、產(chǎn)物不純以及光穩(wěn)定性不佳等，使其在實(shí)際應(yīng)用中受限很大。此外，納米材料有很多傳統(tǒng)的微米尺寸熒光材料沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)，這些性質(zhì)大多數(shù)與顆粒的大小等性質(zhì)密切相關(guān)。通過(guò)改變某些反應(yīng)條件，會(huì)對(duì)化合物的各種性質(zhì)產(chǎn)生影響。因此，有必要對(duì)納米發(fā)光材料的制備過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，以得到各種應(yīng)用中所需要的不同性質(zhì)的納米粒子。

目前，Y2O3已經(jīng)應(yīng)用于很多領(lǐng)域，例如陶瓷[11]、半導(dǎo)體[12]、催化劑[13]和生物探針[14]等。已有研究表明Y2O3上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料可以用于骨修復(fù)材料[15]，且Y2O3:Yb，Er納米粒子有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性，說(shuō)明Y2O3:Yb，Er在生物學(xué)有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而細(xì)胞和Y2O3:Yb,Er納米粒子之間的生物相容性是納米粒子應(yīng)用于生物學(xué)的重要參數(shù)。因此，研究其生物學(xué)性質(zhì)具有很深遠(yuǎn)意義。

本文以硝酸釔和尿素為主要原料，用水熱-煅燒兩步法對(duì)制備Y2O3:Yb,Er納米粒子的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)性質(zhì)探究，為其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

尿素（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硝酸釔（AR，阿拉丁試劑有限公司）；硝酸鐿（AR，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；硝酸鉺、十六烷基三甲基溴化銨（AR，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（AR，常熟市楊園化工有限公司）。

Nano-ZS納米粒度與電位分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Avatar380紅外光譜儀，美國(guó)熱電集團(tuán)；D/max-2550PC X射線粉晶衍射光譜儀，日本Rigaku；FLS-1000熒光光譜儀，天美科學(xué)儀器有限公司；JSM-5600LV場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本JEOL；酶標(biāo)儀，Multiskan Sky；SP8 共聚焦熒光顯微鏡，德國(guó) Leica。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Y2O3:Yb,Er納米粒子的制備

室溫下，將 0.319 2 g 硝酸釔、0.086 2 g 硝酸鐿和0.006 9 g硝酸鉺溶于30 mL去離子水中，再將0.182 2 g十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和1.201 2 g尿素加入去離子水中繼續(xù)溶解。然后將此溶液倒入反應(yīng)釜中，水熱法在160 ℃下反應(yīng)3 h；冷卻后取出，用去離子水和乙醇反復(fù)洗滌，然后離心、干燥。最后將所得產(chǎn)物在600 ℃下煅燒2 h后得到Y(jié)2O3:Yb,Er粉末。

改變水熱法反應(yīng)物溫度（130～200 ℃，10 ℃一個(gè)梯度），得到不同溫度條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子。

用吐溫80取代CTAB作為表面活性劑，或不添加表面活性劑，制備Y2O3:Yb,Er納米粒子。

改變煅燒溫度（200～800 ℃，100 ℃一個(gè)梯度），得到不同煅燒溫度條件下的Y2O3:Yb,Er納米粒子。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用Y2O3:Yb,Er納米粒子為試樣，Hela細(xì)胞為受體。將HeLa細(xì)胞以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種在1640培養(yǎng)基（RPMI-1640,含10%FBS）的96孔板中，并生長(zhǎng)24 h。添加新鮮培養(yǎng)基中濃度為0.7～200 μg/mL的Y2O3:Yb,Er納米粒子作為替代品，并將細(xì)胞孵育24 h。然后除去工作溶液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞兩次。將總計(jì)10 μL的CCK-8（Cell Counting Kit-8，BIOMIKY）添加到每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在5%的CO2濕潤(rùn)的氣氛中于37 ℃進(jìn)一步孵育 1 h。將板搖動(dòng) 5 min，并使用酶標(biāo)儀在 450 nm處測(cè)量吸光度。

1.2.3 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

上述說(shuō)到字幕翻譯一般比較大眾化，有著文化交際的功能。那么，做字幕翻譯一般都是采用簡(jiǎn)單易懂的文字，很少涉及到復(fù)雜難懂的表達(dá)。再者，由于電影具有瞬時(shí)性，每一句臺(tái)詞出現(xiàn)的時(shí)間實(shí)際上是很短暫的，這就要求譯者要將劇情還有角色的情緒在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)出來(lái)，達(dá)到一目了然的效果。

用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在玻底皿中接種30 000個(gè)Hela細(xì)胞。將玻底皿置于培養(yǎng)箱中在37 ℃、5% CO2的 條 件 下 培 育 24 h。Hela細(xì) 胞 首 先 用Y2O3:Yb,Er納米顆粒（事先用聚乙二醇修飾）在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中染色12 h。用PBS洗皿兩次，然后用4%的多聚甲醛固定20 min，細(xì)胞核染料4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，0.08 μg/mL）隨后孵化 30 min。最終用盛著PBS的玻底皿在激光共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 Y2O3:Yb,Er制備條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

圖1為不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb, Er納米粒子與標(biāo)準(zhǔn)卡片的XRD對(duì)比圖。從圖中可以看出，不同溫度下制得的Y2O3:Yb, Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，證實(shí)了Y2O3:Yb, Er納米粒子的形成。

圖1 不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子X(jué)RD圖及與標(biāo)準(zhǔn)卡片的對(duì)比

圖2為不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光譜圖。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在130～160 ℃范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，160 ℃時(shí)，Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨著溫度繼續(xù)升高，Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)閅2O3形成之前為帶結(jié)晶水的碳酸釔[16]，一般情況下，溫度超過(guò)200 ℃后，結(jié)晶水就已經(jīng)完全消失[17]。說(shuō)明在超過(guò)一定溫度時(shí)，會(huì)破壞前驅(qū)體的結(jié)構(gòu)，致使煅燒后產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。

圖2 不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子熒光圖及最大熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)圖

2.1.2 不同表面活性劑對(duì)Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

圖3為不同表面活性劑下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的與標(biāo)準(zhǔn)卡片的XRD對(duì)比圖。從圖中可以看出，不同表面活性劑下制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，證實(shí)了Y2O3:Yb,Er納米粒子的形成。

圖3 不同表面活性劑下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的XRD圖及與標(biāo)準(zhǔn)卡片的對(duì)比

圖4為不同表面活性劑下Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光圖譜。從圖中可以看出，發(fā)射峰基本在同一個(gè)位置，沒(méi)有變化，發(fā)光最強(qiáng)的為以CTAB為表面活性劑制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子，以吐溫80為表面活性劑時(shí)發(fā)光強(qiáng)度次之，當(dāng)無(wú)表面活性劑時(shí)，發(fā)光最弱。因?yàn)檠趸悶闊o(wú)機(jī)晶體，吐溫80作為非離子表面活性劑，游離在溶液中，難以與溶液中離子相結(jié)合，起到促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行的作用。而CTAB為陽(yáng)離子表面活性劑，可以與溶液中的陰離子結(jié)合，使表面活性劑中的氨基帶上正電荷，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。同時(shí)，加入表面活性劑之后，產(chǎn)物的分散性變好，缺陷較少，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度變強(qiáng)。

圖4 不同表面活性劑條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子熒光圖譜及SEM圖：（a）無(wú)表面活性劑；（b）吐溫80；（c）CTAB

圖4中SEM圖通過(guò)Nanometer軟件計(jì)算得出，未加入表面活性劑時(shí)，產(chǎn)物的粒徑為41.0 nm；加入吐溫80時(shí)，產(chǎn)物的粒徑為44.7 nm；加入CTAB時(shí)，產(chǎn)物的粒徑為46.8 nm。加入表面活性劑之后，產(chǎn)物的粒徑變大。聯(lián)系其發(fā)光性能，可以看出，大的顆粒，晶體的完整性好，發(fā)光能力更強(qiáng)；從無(wú)表面活性劑到非離子型表面活性劑再到陽(yáng)離子型表面活性劑，所形成的顆粒變大，可能與其在正生長(zhǎng)的粒子表面的吸附能力差異有關(guān)[18]。

2.1.3 不同煅燒溫度對(duì)Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

圖5為不同煅燒溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子與標(biāo)準(zhǔn)卡片的XRD對(duì)比圖。從圖中可以看出，不同煅燒溫度下制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，證實(shí)了Y2O3:Yb,Er納米粒子的形成。

圖5 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子X(jué)RD圖及與標(biāo)準(zhǔn)卡片的對(duì)比

因?yàn)樵?00 ℃之前沒(méi)有形成Y2O3，沒(méi)有表現(xiàn)出發(fā)光性能，所以只能研究在500～800 ℃不同煅燒溫度下熒光強(qiáng)度的變化。從圖6中可以看出，樣品隨著溫度的升高在600 ℃時(shí)表現(xiàn)出最佳的發(fā)光強(qiáng)度，然后隨著溫度的繼續(xù)升高，熒光強(qiáng)度降低?？赡苁且?yàn)殡S著樣品的結(jié)晶度降低和缺陷的存在，導(dǎo)致發(fā)光性能降低。

圖6 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光譜圖

對(duì)不同煅燒溫度下（200～800 ℃）的產(chǎn)物進(jìn)行紅外測(cè)試分析（圖7），產(chǎn)物經(jīng)500 ℃煅燒2 h后，在1 635 cm-1處 C=O[19]的吸收峰大大減弱。200～800 ℃煅燒后樣品的紅外光譜的峰位置沒(méi)有太大變化，強(qiáng)度有所不同。這可能是因?yàn)榫Я４笮〉淖兓诩t外光譜上體現(xiàn)的不太明顯[20]，而表示碳酸的1 522 cm-1處的特征峰[21]和表示C-O的1 365 cm-1處的特征峰[22]的吸收強(qiáng)度先是隨著煅燒溫度的升高而逐漸減弱，到600 ℃以后，吸收峰的強(qiáng)度基本保持不變。這表明，碳酸的量先是隨溫度升高而減少，600 ℃后基本不變，并且吸收強(qiáng)度弱到幾乎沒(méi)有，而在562 cm-1處的峰，歸屬于Y2O3中Y-O[23]的特征峰，說(shuō)明煅燒至600 ℃時(shí)前驅(qū)體已經(jīng)完全轉(zhuǎn)變?yōu)閅2O3，表明已經(jīng)生成了Y2O3。

圖7 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子紅外光譜

圖8為煅燒前后Y2O3:Yb,Er納米粒子的掃描電鏡圖（SEM），粒徑測(cè)試結(jié)果為煅燒前平均粒徑50.5 nm，煅燒后平均粒徑32.85 nm，煅燒后粒子大小比前驅(qū)體小，且煅燒前后納米粒子的形態(tài)良好。說(shuō)明煅燒后Y2O3:Yb,Er納米粒子也能保持一個(gè)良好的形態(tài)。

圖8 煅燒前（a）和煅燒后（b）Y2O3:Yb,Er納米粒子的SEM圖以及粒徑圖

2.2 Y2O3:Yb,Er納米粒子的生物學(xué)表征

2.2.1 Y2O3:Yb,Er的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

圖9為細(xì)胞孵育24 h后的細(xì)胞活性圖，很直觀地揭示了Y2O3:Yb，Er納米粒子的細(xì)胞毒性。分析對(duì)照組和空白組可知，當(dāng)Y2O3:Yb,Er的濃度高于200 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率依然大于85%。與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物如有機(jī)染料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，Y2O3:Yb,Er納米粒子的毒性很小，體現(xiàn)出良好的生物相容性，說(shuō)明Y2O3:Yb,Er對(duì)細(xì)胞的損傷較小。

圖9 不同濃度Y2O3:Yb,Er對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.2.2 Y2O3:Yb,Er的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

圖10（a）是DAPI染色的細(xì)胞核，圖10（b）是Y2O3:Yb,Er納米粒子在 980 nm 激發(fā)下，500～800 nm范圍內(nèi)的熒光圖像，圖10（d）是將圖10（a）和圖10（b）結(jié)合在一起的圖片，從圖10（d）中可以看出Y2O3:Yb,Er納米粒子已經(jīng)被細(xì)胞吞噬，并包裹在細(xì)胞核周圍，說(shuō)明Y2O3:Yb,Er納米粒子有良好的的生物相容性，可以應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域。

圖10 Y2O3:Yb,Er的細(xì)胞成像圖：（a）DAPI，0.08 mg/mL；（b）Y2O3:Yb,Er熒光偽彩圖像（500～800 nm），980 nm激發(fā)；（c）明場(chǎng)圖片：（d）a和b的合并圖像

3 結(jié)論

用水熱-煅燒兩步法制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子平均粒徑為32.85 nm。Y2O3:Yb,Er納米粒子在600 ℃煅燒下?lián)碛辛己玫木秃桶l(fā)光強(qiáng)度，比一般文獻(xiàn)中報(bào)道的煅燒溫度都低。此外，Y2O3:Yb,Er納米粒子幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，并且具有很好的生物相容性，這對(duì)Y2O3:Yb,Er納米粒子在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的價(jià)值。