徐帥，郝琴，陳宏波，向陽*

（1.湖南省汨羅市食品藥品檢驗所，湖南岳陽 414400；2.湖南理工學院，湖南岳陽 414006）

隨著生物研究的深入，人類和各種動植物基因組序列被預測出來，致使更多的基因信息被釋放出來，基因功能的研究也就越來越重要[1]?，F如今男子精子的數量和質量呈現明顯下降趨勢，導致不育的情況多樣且復雜，生殖相關基因的突變引起的男性生殖功能障礙是目前研究的熱點問題之一[2]。在睪丸中表達的基因眾多，依然有許多未知基因參與精子發(fā)生的調控，發(fā)現和研究睪丸特異性基因是一項重要的研究工作[3]。研究表明含LRR結構域的蛋白質主要在各種細胞的信號傳遞、RNA加工、細胞周期調控、細胞凋亡和轉錄調控等方面起作用[4-5]，因此本研究通過生物信息學方法將克隆重疊群中的EST序列經修正和拼接后得到一個新的睪丸表達基因LRRC34，通過基因克隆技術進一步對這個新基因進行研究分析，確認該基因是否參與精子發(fā)生的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

多只成年KM小白鼠，總RNA抽提試劑盒購自于Omega公司；逆轉錄試劑盒購自于Fermentas公司；PCR擴增試劑盒購自于Thermo Scientific公司；質粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、Solution I連接試劑盒、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體和DNA鏈接試劑盒均購自TaKaRa公司；電泳試劑、Trizol、LB培養(yǎng)基試劑、DEPC等試劑和普通Taq DNA聚合酶均購自于上海生物工程公司；SUPERSCRIPTTMⅡ逆轉錄酶購自于GIBCO BRL公司；50×Advantage 2高保真DNA聚合酶購自于Promega公司；dNTP mix、DNase I均購自于 MBI公司；氨芐青霉素Amp和卡那霉素Kan、CaCl2均購自于BIOSHARP公司進口分裝；瓊脂糖和染色劑EB均購自于BIOWEST 公司；DL3000 DNA Marker為北京天根生化科技公司產品；E.coli Top10為大腸桿菌細胞株系，為本實驗室分離純化后而保存的菌株。RT-PCR中陽性對照GAPDH引物與小鼠LRRC34克隆引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成[6-7]。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析

利用NCBI網站找到多個EST序列片段，通過拼接技術獲得一個新基因，再利用Translate軟件把核酸序列翻譯成蛋白質序列，再采用NCBI中的ORF finder進行閱讀框架的識別并用RT-PCR對該閱讀框架進行驗證；采用NCBI中的BLAST進行核酸和蛋白質序列相似性比對；應用NCBI中的Map View軟件進行染色體定位；采用Webcutter 2.0軟件進行酶切位點分析，并設計出構建表達載體的引物；采用GENESCAN和FGENEH等基因預測軟件進行內含子和外顯子分析；采用ExPASy服務器中的ProtParam tool和TMpred軟件分別進行蛋白質理化性質、跨膜區(qū)和疏水性分析；利用ExPASy中的SignalP V1.1進行信號肽序列分析[7]。

2.2.2 小鼠多組織總RNA抽提

采用Trizol法提取總RNA：扯尾壓頸法快速處死成年雄性和雌性小白鼠各一只[8]；解剖小白鼠，分別取睪丸、附睪、腎臟、大腦、小腦、心臟、肺、肝、大腸、小腸、尾巴、耳朵等組織并用Trizol法提取各組織的總RNA。提出各組織總RNA后再用逆轉錄試劑盒將其轉錄成cDNA第一鏈接。

1.2.2 RT-PCR擴增LRRC34新基因全長

根據拼接后得到的小鼠LRRC34基因cDNA序列在閱讀框兩側設計引物對，其上游引物可設計為LRRC34-F：5'z-GGCGGCCTTCCTCTTTAGA-3'； 其 下游引物可設計為LRRC34-R：5'-TTCTGTGGCTTGTTTCAGGG-3'；擴 增 產 物 大 小 為 1 557 bp。 同 時 管家基因GAPDH設計的上游引物GAPDH-F：5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3'；設計的下游引物為GAPDH-R：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'；擴增產物大小為499 bp，用來做RT-PCR陽性對照。

以Trizol法提取的大鼠多組織mRNA為模板，逆轉錄合成cDNA第一鏈，分別用GAPDH和LRRC34的引物作為引物進行RT-PCR擴增。以睪丸cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，在10 μL的體系中加入以下物質：ddH2O7.1 μL，10×buffer（無 Mg2+、KCl）1.0 μL，dNTP Mix（10 mmoL/L）0.5 μL，Primer LRRC34-F 0.2 μL，Primer LRRC34-R 0.2 μL，睪丸 cDNA 第一鏈（模板）0.8 μL，Mg2+0.7 μL，Taq DNA 聚 合 酶 0.2 μL。 在 2720型 PCR 儀（Applied Biosystems公司，美國）完成PCR擴增，經過多次PCR摸索，反應條件如下：先95 ℃預變性3 min；再95 ℃變性 30 s，62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，完成 35 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min，置于 4 ℃保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA第一鏈效果并分析。其次再用高保真DNA聚合酶進行LRRC34基因的高保真PCR擴增。將高保真PCR產物連接到pMD18-T Vector Kit載體上，轉化到E.coliTop10 大腸桿菌，將陽性克隆菌液發(fā)送到上海生工生物工程股份有限公司測序分析[6-7]。

1.2.4 多組織RT-PCR

以小鼠睪丸、腎臟、附睪、大腦、小腦、心臟、肺、肝、大腸、小腸、尾巴和耳朵等多組織mRNA為模板利用逆轉錄試劑盒逆轉錄成多組織cDNA第一鏈，然后用多組織cDNA第一鏈為模板進行多組織RT-PCR，反應體系和實驗方法與1.2.3相同，得到的克隆產物再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平[6]。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析結果

經生物信息學分析，LRRC34基因定位于小鼠3號染色體，并且含有11個外顯子，10個內含子。該基因的cDNA全長序列為1 840 bp，其中開放閱讀框為1 248 bp，編碼了一個含有415個氨基酸殘基的蛋白質。在161～163核苷酸位置有一個起始密碼子ATG，在1 406～1408核苷酸位置有一個終止密碼子TAA。ORF起始處序列為tcgATGg，符合Kozak規(guī)則，在序列的3'端則有一個加尾信號AATAAA，內含子與外顯子界限的劃分符合典型的GT/AG規(guī)則。

2.2 小鼠多組織RT-PCR擴增

如圖1示，利用管家基因GAPDH的引物和多組織cDNA第一鏈接為模板進行PCR擴增來檢測cDNA第一鏈的效果?？寺‘a物片段長度約為500 bp，與管家基因GAPDH預期片段長度499 bp基本相符，說明用小鼠多組織mRNA逆轉錄合成cDNA第一鏈非常成功，其中睪丸組織cDNA可以直接作為擴增LRRC34基因的模板，而其他cDNA第一鏈也可以做不同組織的表達差異的PCR反應模板。

圖1 RT-PCR檢測小鼠多組織cDNA第一鏈

2.3 克隆LRRC34基因

通過改變退火溫度進行最佳條件的探索，得到該基因的最佳退火溫度為62 ℃，在最佳PCR克隆條件下對LRRC34基因進行PCR擴增（如圖2示）。從圖2中可看到，小鼠睪丸組織擴增出特異性產物，且基因片段長度在 1 000～2 000 bp 之間，這與 LRRC34基因預期片段長度1 557 bp大體相符，說明該基因確實在小鼠睪丸組織中有表達，LRRC34基因被成功地擴增。將克隆產物連接到pMD18-T Vector Kit載體上，經測序，結果與序列完全一致，說明拼接序列是正確的。然后將含有LRRC34基因T載體的E.coli Top10菌液培養(yǎng)，抽質粒保存在超低溫冰箱用于做后續(xù)實驗。

圖2 小鼠睪丸組織克隆LRRC34基因

2.4 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平

以逆轉錄合成的小鼠多組織cDNA第一鏈為模板，用LRRC34的設計的引物作為引物，使用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增LRRC34基因（如圖3示）。從圖3可看到，LRRC34基因僅在小鼠睪丸組織中有表達，而在小鼠其他組織中均不表達，從這一點說明LRRC34基因具有組織特異性，故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達基因。

圖3 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平

3 討論

近年來，男性生殖域基因功能的研究是男性科學研究的熱門領域之一[2]。而研究精子發(fā)生機制與發(fā)現特異性睪丸表達新基因也是研究的重點。由于人類基因圖譜已經出來，而人類基因大約在3萬～4萬個，且并不是每個基因都在人體表達[9]，如果要研究生殖域基因功能，可以通過生物信息學方法將該克隆重疊群中的EST序列經BLAST修正后進行拼接獲得一個新的未知序列，尋找新的組織特異性EST，從而可以找到生殖域表達的特異新基因，為科研工作提供一種簡單便利的新方法[10-11]。

本研究根據獲得的序列設計引物對，以大鼠睪丸組織cDNA文庫為模板進行擴增，克隆出了一個新基因LRRC34，基因產物為睪丸生精細胞凋亡相關蛋白。綜合運用NCBI數據庫中的BLAST和Expasy中的TMpred、Protparam tool等軟件較全面地分析了該基因的生物信息：LRRC34基因的cDNA全長序列為1 840 bp，其中開放閱讀框為 1 248 bp，編碼了一個含有415個氨基酸殘基的蛋白質；將LRRC34基因cDNA序列與小鼠基因組序列比較，發(fā)現該基因定位于大鼠3號染色體，并且含有11個外顯子，10個內含子。LRRC34基因在大鼠多組織中的RT-PCR結果顯示：該基因僅在正常成年雄鼠睪丸組織中特異性高表達，而在小鼠其他組織中均無明顯表達。說明LRRC34基因具有組織特異性，故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達基因，該基因與生殖及精子發(fā)生有關，其可能在睪丸發(fā)育和精子形成的過程中起重要作用。生物信息分析表明LRRC34基因與人類同源基因相似性達78%，因此可以通過對小鼠LRRC34基因的研究來初步預測人的部分性狀，為人類雄性精子發(fā)生的分子機制和生精細胞凋亡的生理機制的研究提供理論依據，同時對相關疾病的診斷、治療也具有十分重要的現實意義。

本研究中所克隆的基因LRRC34只在小鼠睪丸組織特異性表達，其極可能與小鼠生精細胞凋亡密切相關，雖然要弄清LRRC34基因與生精細胞凋亡的關系還有待于進一步的實驗研究，但這些結果為后續(xù)研究生殖領域新基因生精細胞凋亡的分子機制提供了新思路，展示了新途徑。