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蔓三七葉多糖的柱層析純化及理化性質(zhì)研究

2020-03-07 04:59李華勇胡居吾
生物化工 2020年1期
關(guān)鍵詞:氯乙酸柱層析葡聚糖

李華勇,胡居吾

(1.江西省吉安市食品藥品檢驗檢測中心,江西吉安 343000;2.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,江西南昌 330096)

蔓三七,又名平臥菊三七,為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養(yǎng)豐富,富含粗多糖和綠原酸等成分,多利用其消炎止咳、通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛,可用于治療肺結(jié)核、支氣管肺炎等[1]?,F(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明,蔓三七具有消炎止咳,散淤消腫等功效[2],還具有提高人體免疫力、改善機體免疫功能的作用[3],降血糖、降血壓和抑制乙型肝炎的顯著效果[4]。蔓三七又和木耳菜同屬,食味柔滑,清香可口,具有極好的營養(yǎng)價值;可清炒、涼拌、氽湯,其葉也可生吃,或取鮮葉開水沖泡當(dāng)茶飲,具有較高的經(jīng)濟價值。其中含有的多糖具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)及豐富的生物活性,包括抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抑制血管生成[7]、抗感染[8]、改善免疫功能[9]、調(diào)節(jié)血糖血脂[10]、保肝[11]等多種功效。

植物多糖經(jīng)提取后,提取液中常含有蛋白質(zhì)、色素、單糖、無機鹽和各種小分子雜質(zhì),需要對粗多糖進(jìn)行分離純化。由于色素、小分子雜質(zhì)在原料預(yù)處理(石油醚脫脂、乙醇浸泡)和醇沉過程中幾乎被除去,因此除蛋白是多糖純化過程中的重要環(huán)節(jié),常用除蛋白的主要方法為Sevage法、木瓜蛋白酶法、三氯乙酸法等[12-13]。為了獲得純多糖組分,還需通過色譜柱法或分級沉淀法對除蛋白多糖進(jìn)一步分離。

本研究采用三氯乙酸法對蔓三七葉粗多糖進(jìn)行除蛋白,并利用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-75葡聚糖凝柱對除去蛋白的蔓三七葉多糖分離純化,同時對純化后的蔓三七葉多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓三七葉,購買自江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,烘干、粉碎后過20目篩備用。

三氯乙酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、碘化鉀、牛血清蛋白、氯化鈉,均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);纖維素填料 DEAE-52、葡聚糖凝膠G-75均為索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6090Z型真空干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;UV-1800 紫外可見分光光度計,日本島津儀器有限公司;METTLER-TOLEDOAL104型電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;FD-1C-50冷凍干燥機,上海豫明儀器有限公司;層析柱(3 cm×30 cm),上海滬西分析儀器廠;CTO-20A柱溫箱、RLO-10Z示差折光檢測器,日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蔓三七葉粗多糖的提取

取烘干、粉碎后的蔓三七葉,按料液比1∶15加入蒸餾水,于65 ℃恒溫水浴2.5 h,離心、抽濾,濾渣部分繼續(xù)用同樣方法浸提,上清液合并濃縮后緩慢加入4倍體積的無水乙醇沉淀粗多糖,于4 ℃低溫靜置24 h,再以 4 800 r/min 離心 10 min,收集下層粗多糖沉淀,最后用無水乙醇洗滌2次,沉淀物用65 ℃超純水溶解、備用[14]。

1.3.2 蔓三七葉粗多糖中蛋白的去除

1.3.2.1 蛋白去除

采用三氯乙酸法除去蔓三七葉粗多糖中的蛋白質(zhì)。將1.3.1下提取的蔓三七葉粗多糖溶解于蒸餾水并置于冰浴中,緩慢加入15%的三氯乙酸,不斷攪拌直至溶液的pH為2~3,4 ℃下保持1 h,以達(dá)到蛋白質(zhì)與多糖分離的效果。將溶液取出,離心15 min,收集上清液,濃縮,冷凍干燥得蔓三七葉除蛋白多糖樣品[15]。

1.3.2.2 除蛋白多糖中蛋白質(zhì)含量的測定

參照考馬斯亮藍(lán)法并稍作修改。配置0.1 mg/mL的牛血清蛋白溶液,分別稱取 0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL至7個試管中,依次加蒸餾水補充到1 mL,再分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑,立即搖勻,靜置10 min。以第1只試管中的溶液作參比,測定595 nm處的吸光度,繪制牛血清蛋白溶液和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將多糖樣品配置成一定濃度,取1 mL按照上述操作測定樣品中蛋白質(zhì)含量。根據(jù)公式1和公式2計算蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率。

1.3.3 蔓三七葉多糖的DEAE-52纖維素柱層析

1.3.3.1 DEAE-52纖維素的預(yù)處理及裝柱

將干燥的DEAE-52纖維素用蒸餾水浸泡24 h,使其充分溶脹,并不斷攪拌以除去泡沫和雜質(zhì)。將溶脹好的DEAE-52纖維素放置于0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min,反復(fù)用蒸餾水洗至中性;再將堿處理后的DEAE-52纖維素置于0.5 mol/L的HCl溶液中浸泡30 min,用蒸餾水洗至中性,最后再置于0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min,蒸餾水洗至中性備用[12]。將預(yù)處理好的DEAE-52纖維素用適量蒸餾水溶解,攪拌均勻,緩慢地倒入層析柱(3.0 cm×30 cm),盡量避免裝柱過程產(chǎn)生氣泡,必要時可進(jìn)行加壓裝填。為了使柱料穩(wěn)定,需用蒸餾水平衡過夜。

1.3.3.2 多糖的DEAE-52纖維素柱層析

準(zhǔn)確稱取200 mg去除蛋白的蔓三七葉多糖樣品,用極少量的蒸餾水溶解。將溶解的蔓三七葉多糖樣品用膠頭滴管沿著層析柱壁緩慢加入,待樣品進(jìn)入柱層析穩(wěn)定后,依次用蒸餾水和NaCl溶液(0.05 moL/L、0.10 moL/L、0.20 moL/L)以 1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。每管收集5 mL,并通過苯酚-硫酸法對每管中多糖的含量進(jìn)行監(jiān)測,繪制洗脫管數(shù)和吸光度值的洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線的峰形,分別收集洗脫液。然后對洗脫液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥,獲得初步分離的蔓三七葉多糖組分,進(jìn)行下一步SephadexG-75葡聚糖凝膠柱層析分離研究[15]。

1.3.4 蔓三七葉多糖的Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析

1.3.4.1 Sephadex G-75葡聚糖凝膠的預(yù)處理及裝柱

將干燥的Sephadex G-75葡聚糖凝膠粉末用蒸餾水煮沸3 h,使其充分溶脹。采用濕法裝柱,將預(yù)處理好的葡聚糖凝膠用適量蒸餾水溶解并攪拌均勻,緩慢地倒入層析柱(3.0 cm×50 cm),避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡和流干水分。裝好的層析柱用蒸餾水平衡過夜。

1.3.4.2 蔓三七葉多糖的Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析

將通過DEAE-52纖維素柱收集到的蔓三七葉多糖組分溶解于蒸餾水,并利用膠頭滴管沿柱壁緩慢加入,待樣品溶液穩(wěn)定后,用蒸餾水以0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。每管收集2 mL,共收集60管。再次用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測,繪制洗脫曲線。收集蔓三七葉多糖含量較高的組分,濃縮、冷凍干燥獲得蔓三七葉純多糖組分[15]。

1.3.5 蔓三七葉純多糖理化性質(zhì)的測定

1.3.5.1 物理狀態(tài)檢測

對蔓三七葉純多糖的顏色、形態(tài)以及溶解性進(jìn)行觀察。

1.3.5.2 化學(xué)檢測

考馬斯亮藍(lán)試驗:參照1.3.2.2蛋白質(zhì)含量的測定方法,將蔓三七葉純多糖組分用蒸餾水溶解,加入5 mL考馬斯亮藍(lán),混合均勻后觀察其顏色變化。

苯酚-硫酸試驗:參照胡居吾等[14]測定多糖含量的方法,將蔓三七葉純多糖組分用蒸餾水溶解,加入1 mL苯酚,再緩慢加入濃硫酸,混合后觀察顏色變化,并測定其多糖含量。

碘化鉀試驗:將蔓三七葉純多糖組分用蒸餾水溶解,加入幾滴碘-碘化鉀溶液,觀察其顏色變化,判斷是否為淀粉類多糖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖中蛋白質(zhì)去除率的測定

2.1.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖1所示。回歸方程y=7.794 5x+0.065 6(R2=0.999 7)。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 粗多糖蛋白質(zhì)去除率

蔓三七葉粗多糖被三氯乙酸除蛋白后,多糖中大部分蛋白質(zhì)已被除去。經(jīng)計算,蔓三七葉粗多糖中的蛋白質(zhì)去除率為93.35%,蔓三七葉粗多糖保留率為84.27%。

2.2 DEAE-52纖維素柱純化結(jié)果

從洗脫曲線(圖2)可以看出,在本試驗洗脫條件下得到4個洗脫峰,分別是以蒸餾水及0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.20 mol/L 的 NaCl溶液洗脫得到。這是由于蔓三七葉多糖在以蒸餾水作洗脫溶液時,有些不帶電多糖或者帶有很弱的負(fù)電荷多糖不能被DEAE-52纖維素吸附或者吸附很弱,首先隨著蒸餾水洗脫下來,即是圖中的第1個洗脫峰。而多糖中帶有負(fù)電荷的部分,被DEAE-52纖維素所吸附,必須用比DEAE-52纖維素吸附更強的Cl-、OH-來洗脫,才能將這部分蔓三七葉多糖洗脫下來。由圖2洗脫曲線可以看出,在以不同濃度NaCl洗脫時均能得到或高或低的洗脫峰,考慮到節(jié)省時間和節(jié)約成本等因素,選取第1個峰位置與第4個峰位置進(jìn)行收集,即分別以蒸餾水和0.2 mol/L的NaCl溶液作為洗脫液,洗脫下的多糖分別為蔓三七葉中性多糖(GPLP-D1)和蔓三七葉酸性多糖(GPLP-D2)。

圖2 DEAE-52洗脫曲線

2.3 Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析洗脫

蔓三七葉多糖組分中性多糖(GPLP-D1)和蔓三七葉酸性多糖(GPLP-D2)分別經(jīng)過Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析的洗脫結(jié)果如圖3a和圖3b所示。由圖3a和圖3b可知,蔓三七葉中性多糖(GPLP-D1)和蔓三七葉酸性多糖(GPLP-D2)經(jīng)蒸餾水洗脫后均出現(xiàn)單一的吸收峰,分別收集兩種洗脫液,濃縮、冷凍干燥后分別得到蔓三七葉中性純多糖(GPLP-S1)和蔓三七葉酸性純多糖(GPLP-S2)。

圖3 Sephadex G-75 洗脫曲線

2.4 GPLP-S1和GPLP-S2理化性質(zhì)的測定

GPLP-S1和GPLP-S2的理化性質(zhì)如表1所示。GPLP-S1和GPLP-S2均為白色粉末,都易溶于水,不易溶于乙醇、丙酮等有機試劑。GPLP-S1、GPLP-S2與苯酚-硫酸反應(yīng)后均顯示出多糖成分,與考馬斯亮藍(lán)和碘化鉀反應(yīng)后顏色均無明顯改變,表明兩種多糖是非淀粉多糖且不含蛋白質(zhì),多糖純度分別為91.65%和92.06%。

3 結(jié)論

本研究首先在最佳條件下對蔓三七葉粗多糖進(jìn)行提取,然后采用三氯乙酸法除蛋白,再通過DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步分離純化,最后測定了蔓三七葉純多糖組分GPLP-S1和GPLP-S2的理化性質(zhì)。主要結(jié)論如下:

(1)經(jīng)過三氯乙酸除蛋白后,蔓三七葉多糖中蛋白質(zhì)去除率為92.35%,多糖保留率為82.74%,表明蔓三七葉多糖中的蛋白質(zhì)可通過三氯乙酸法除去。

表1 GPLP-S1和GPLP-S2理化性質(zhì)

(2)蔓三七葉粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析分離純化后得到純多糖組分GPLP-S1和GPLP-S2。

(3)GPLP-S1和GPLP-S2的物理狀態(tài)檢測顯示,兩者形態(tài)均為白色粉末,易溶于水,不易溶有機試劑;GPLP-S1和GPLP-S2的化學(xué)試驗結(jié)果顯示,兩者均不含蛋白質(zhì),都具有多糖成分且是非淀粉類多糖,多糖純度分別為91.56%和90.78%。

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