李樹文 ，徐麗麗 ，于 浩 ，郭立忠 **

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

鹽堿地是一個(gè)世界性資源與環(huán)境問題，由于工業(yè)化的快速發(fā)展和人口數(shù)量的急劇膨脹，造成農(nóng)田、山林、牧地的過渡開墾，化肥的過渡使用、植被的過渡破壞甚至是氣候的異常變化，從而加速了土壤的鹽堿化進(jìn)程。全球鹽漬化土壤面積約為1×109hm2，我國鹽堿地總面積約為0.991×108hm2，為第三大鹽堿地分布國家，其中潛在鹽漬化土壤為0.173×108hm2[1-2]。可見，鹽堿地是重要的后備土地資源，其科學(xué)開發(fā)、合理利用對(duì)維護(hù)生態(tài)平衡、緩解耕地緊缺、推動(dòng)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展及其可持續(xù)發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)意義[1-2]。而鹽堿地耐鹽作物或鹽生作物的栽培對(duì)其開發(fā)利用及其改良和治理具有重要意義。

羊肚菌（Morchella spp.）因子實(shí)體外形似羊肚而得名，是一種名貴的食（藥） 用菌，具有保肝、降血脂、抗腫瘤、抗氧化以及增強(qiáng)免疫力等保健價(jià)值[3]。自21世紀(jì)初我國掌握了野外栽培羊肚菌的技術(shù)，由于栽培過程簡單、設(shè)施構(gòu)造低廉、產(chǎn)品價(jià)值高、可套種農(nóng)作物等特點(diǎn)，羊肚菌栽培得到了迅速而大面積的推廣，2015年～2016年羊肚菌栽培面積達(dá)1 600 hm2[4]。關(guān)于羊肚菌在鹽堿地中栽培菌株的篩選、育種以及栽培管理和設(shè)施優(yōu)化等方面的研究未見報(bào)道，通過以試驗(yàn)室目前保存的能進(jìn)行人工栽培的羊肚菌菌株以及采集的野生菌株為研究對(duì)象，從NaCl濃度和pH兩個(gè)方面進(jìn)行耐鹽堿菌種的篩選試驗(yàn)，為未來鹽堿地栽培羊肚菌的研究提供菌種資源和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種于2017年3月～4月分別采集于山東省文登市（命名為文登）、山東省煙臺(tái)市（命名為煙臺(tái)）、山東省諸城市（命名為51號(hào)），及試驗(yàn)室保存種（命名為2-4），其中文登和煙臺(tái)鑒定為梯紋羊肚菌（Morchella importuna），2-4為尖頂羊肚菌（Morchella conica），51號(hào)是野外采集種，經(jīng)鑒定為尖頂羊肚菌（Morchella conica），保存于山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)試驗(yàn)室。PDA培養(yǎng)基115℃滅菌30 min，接菌后培養(yǎng)溫度25℃。

1.2 試驗(yàn)儀器

MLS-3750全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，日本三洋（SANYO）；HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海淮宇儀器設(shè)備有限公司；THG-9070A鼓風(fēng)干燥箱，蘇州正合測試設(shè)備有限公司；BSA224S電子天平，Sartorius；PHS-3EpH計(jì)，上海雷磁；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，蘇州凈化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 pH對(duì)羊肚菌菌絲生長的影響

PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH：培養(yǎng)基滅菌后，經(jīng)pH調(diào)節(jié)預(yù)試驗(yàn)后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)以無菌操作方式加入已滅菌的1 mol·L-1NaOH，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6.71（對(duì)照）、7.50、8.09、8.33和 8.50。倒平板，冷卻凝固后接種4株菌株培養(yǎng)2 d時(shí)的菌餅（直徑6 mm），各pH接種3個(gè)重復(fù)；培養(yǎng)29 h后直尺測量并記錄菌落直徑。

PDA培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH：培養(yǎng)基制備時(shí)，加入1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為 6.39（編號(hào)PDA-1）、8.34（編號(hào) PDA-2）、9.28（編號(hào) PDA-3）和10.03（編號(hào)PDA-4），高壓蒸汽滅菌后測定培養(yǎng)基pH，倒平板，冷卻凝固后接種4株菌株培養(yǎng)2 d時(shí)的菌餅（直徑6 mm），各pH接種3個(gè)重復(fù)；培養(yǎng)48 h后直尺測量并記錄菌落直徑。

1.3.2 不同濃度NaCl對(duì)羊肚菌菌絲生長的影響

選擇在近似于濱海鹽堿地pH（7.5～8.5）[5]的培養(yǎng)基中接種菌絲生長速度最快的菌株進(jìn)行不同鹽濃度的試驗(yàn)。將不同質(zhì)量的NaCl加入培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)滅菌后NaCl濃度（w/v） 為0（對(duì)照）、1.0%、2.0%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%。倒平板，接種過程和測量過程與2.3.1相同。鹽濃度對(duì)菌絲生長的抑制率（Y，%）的計(jì)算公式為：

式中：CKR為對(duì)照菌落直徑（mm）；R為各鹽度菌落直徑（mm）。

1.3.3 耐鹽菌株的傳代馴化

選擇最耐鹽菌株進(jìn)行傳代馴化試驗(yàn)，接種過程和測量過程與2.3.1同，傳代馴化流程試驗(yàn)設(shè)計(jì)見圖1～圖3。

如圖1～圖3所示，3%～3%逐級(jí)馴化為菌株在不含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后依次轉(zhuǎn)接于含鹽量1%、2%、3%的培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)5 d，后于鹽含量3%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑。0～3%傳代培養(yǎng)為菌株在不含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后連續(xù)轉(zhuǎn)接于不含鹽培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)5 d，后于鹽含量3%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑。0～0對(duì)照傳代培養(yǎng)為菌株在不含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后連續(xù)轉(zhuǎn)接于不含鹽培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)5 d，于最后1個(gè)不含鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)羊肚菌菌絲生長的影響

試驗(yàn)選擇了近似濱海鹽堿地的pH（7.50～8.50）[5]。PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH，培養(yǎng)29 h后各菌株的菌落直徑見圖4。

由圖4可知，各菌株均可在pH 7.50～8.50內(nèi)生長，其中菌株51號(hào)pH在7.50時(shí)菌絲生長速率為1.21 mm·h-1，高于對(duì)照 1.17 mm·h-1，總體與對(duì)照近似；菌株2-4在pH 7.50時(shí)菌絲生長速率與對(duì)照1.52 mm·h-1相近，但總體低于對(duì)照；文登菌絲生長速率在pH 8.09時(shí)為1.76 mm·h-1，但總體均低于對(duì)照1.79 mm·h-1；煙臺(tái)菌株pH在8.33時(shí)菌絲生長速度與對(duì)照1.48mm·h-1相近，但總體低于對(duì)照。不同pH對(duì)菌株生長影響的方差分析結(jié)果，見表1。

表1 不同pH條件下各菌株菌落直徑的方差分析Tab.1 Anova analysis of the colony diameters of Morchella spp.under the condition of different pH

由表1可知，試驗(yàn)設(shè)置的pH對(duì)51號(hào)菌株、2-4菌株和文登菌株的生長均未有顯著影響（F＜Fcrit，P＞0.05），而對(duì)煙臺(tái)菌株的生長具有顯著影響（F＞Fcrit，P＜0.05）。結(jié)合圖4試驗(yàn)整體結(jié)果，各菌株的生長速率快慢為：文登菌株＞2-4菌株＞煙臺(tái)菌株＞51號(hào)菌株。綜上所述，應(yīng)選擇生長速率快且試驗(yàn)pH對(duì)其生長未有顯著抑制作用的文登菌株和2-4菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。PDA培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH，經(jīng)過滅菌后，培養(yǎng)基pH變化見表2。

表2 PDA培養(yǎng)基滅菌前后pH變化情況Tab.2 pH changes before and after sterilizing PDA medium

由表2可知，滅菌后培養(yǎng)基pH均比原來低，且滅菌前pH越高，滅菌后pH下降越快。滅菌前調(diào)節(jié)pH為6.39～10.03，滅菌后pH為6.12～7.14，其對(duì)羊肚菌菌落直徑的影響見圖5，滅菌前調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH對(duì)羊肚菌菌落直徑的方差分析結(jié)果見表3。

表3 PDA滅菌后pH變化對(duì)羊肚菌菌落直徑的方差分析Tab.3 Anova analysis of the colony diameters of of Morchella spp.with changes of pH after sterilizing PDA medium

由圖5、表3可知，滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，其滅菌后對(duì)文登和2-4菌株菌絲的生長有顯著影響（P＜0.05），其中對(duì)2-4菌株菌絲生長的影響極顯著（P＜0.001），如果依據(jù)該結(jié)論，則得出pH 6.12～7.14對(duì)菌絲生長有顯著影響，而與前面的研究結(jié)果不一致。不同羊肚菌生長pH范圍和培養(yǎng)基種類見表4。

表4 不同羊肚菌生長的pH范圍和培養(yǎng)基種類Tab.4 pH ranges and culture media of Morchella spp.in the references

由表4可知，本試驗(yàn)研究所得羊肚菌菌絲可生長的pH與謝放[6]、陳易飛[7]、肖鋒[8]的研究結(jié)果具有一致性。而李潔[9]、李小燕[10]、周潔[11]的研究表明，pH＞8.00羊肚菌菌絲生長將受到抑制。原因可能是培養(yǎng)基成分產(chǎn)生差異，當(dāng)加入NaOH進(jìn)行pH調(diào)節(jié)高壓滅菌后，導(dǎo)致沉淀物的生成或發(fā)生美拉德反應(yīng)[12]，不利于菌絲生長；或者培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)造成，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)的pH與滅菌后培養(yǎng)基的pH存在差異[13]，滅菌后pH變化太大時(shí)抑制菌絲生長。

2.2 NaCl濃度對(duì)羊肚菌菌絲生長的影響

不同NaCl濃度對(duì)2-4及文登菌株菌落直徑的影響見圖6。

由圖6所示，在試驗(yàn)鹽度范圍內(nèi)（鹽濃度大于1.0%），文登菌株和2-4菌株菌絲均可生長，但隨鹽度的增加，與對(duì)照比較，菌絲生長量受到明顯抑制。鹽度對(duì)2株菌的抑制率不同，文登菌株在各鹽度下的耐鹽能力均高于2-4菌株，鹽濃度5.0%時(shí)，其對(duì)2-4菌株和文登菌株的抑制率分別為92%和86%，可見文登菌株耐鹽性更強(qiáng)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，2株菌株均能在高鹽的培養(yǎng)基中生長，但菌絲生長速率存在差異。不同培養(yǎng)時(shí)間段鹽度對(duì)菌絲生長速度的影響見圖7，其抑制率結(jié)果見表5。

表5 鹽度對(duì)菌絲生長的抑制率（105 h）Tab.5 The inhibition rate of salt concentration on mycelial growth(105 h)

由圖7、表5可知，對(duì)于2-4菌株，在3.0%～3.5%鹽濃度下，后期培養(yǎng)（培養(yǎng)時(shí)間為105 h～132 h）生長速率略有下降外，其他濃度后續(xù)培養(yǎng)的速率均高于前期培養(yǎng)（培養(yǎng)時(shí)間為48 h～105 h） 速率。對(duì)于文登菌株，在3.5%～4.5%鹽濃度下，后期生長速率明顯下降，尤其在3.5%～4.0%時(shí)的鹽濃度；2.0%～3.0%鹽濃度下生長速率前期與后期基本一致或后期生長速度略高于前期；當(dāng)鹽濃度達(dá)到5.0%時(shí)，后期菌絲生長速率高于前期。雖然鹽濃度對(duì)文登菌株的生長速率影響較大，但是在各鹽濃度的培養(yǎng)基上，文登菌株的生長速率均高于2-4菌株，所以后續(xù)耐鹽試驗(yàn)將以文登菌株為馴化對(duì)象以期提高其耐鹽性。

2.3 耐鹽菌株馴化

對(duì)文登菌株進(jìn)行3組馴化試驗(yàn)，其馴化結(jié)果見圖8。馴化菌株與未馴化菌株菌落直徑的差異性分析見表6。

表6 馴化菌株與未馴化菌株菌落直徑的差異性分析Tab.6 Difference analysis of colony diameters between acclimated strain and original strain

由圖8、表6可知，以文登菌株為試驗(yàn)對(duì)象，采用逐級(jí)增加鹽濃度（3%～3%） 的方式進(jìn)行耐鹽菌株馴化，結(jié)果表明在鹽度3%的培養(yǎng)基中，雖然馴化后菌株菌落直徑（18.2 mm） 略高于未經(jīng)馴化（15.5 mm），但是逐級(jí)馴化后的菌株與未經(jīng)馴化的菌株菌絲生物量之間無顯著差異，F(xiàn)＜Fcrit。還需通過物理、化學(xué)、生物誘變以及基因工程等方法選育耐鹽的新菌株，以進(jìn)一步適應(yīng)鹽漬化土壤和鹽土環(huán)境的生長。

3 結(jié)論

從pH和NaCl濃度2個(gè)方面進(jìn)行耐鹽堿性羊肚菌菌株的篩選研究，51號(hào)菌株、2-4菌株、文登菌株、煙臺(tái)菌株均能在鹽堿地的pH范圍內(nèi)生長，其環(huán)境pH對(duì)51號(hào)菌株、2-4菌株、文登菌株生長無顯著影響，且文登菌株和2-4菌株的生長速率高于51號(hào)菌株。耐鹽性研究表明，文登菌株和2-4菌株均可生長在鹽度1.0%～5.0%的培養(yǎng)基中，與對(duì)照相比較，隨鹽度的增加，菌絲生長受到明顯抑制，但均具有較強(qiáng)的耐鹽能力，其中文登菌株具有較快的生長速度，但逐級(jí)馴化的抗鹽文登菌株與未經(jīng)馴化菌株的耐鹽性未見顯著性差異。

據(jù)報(bào)道，在華北地區(qū)的鹽堿地，含鹽量＜0.2%為非鹽漬化土壤；0.2%～0.3%為輕度鹽漬化土壤；0.3%～0.4%為中度鹽漬化土壤；0.4%～0.6%為重度鹽漬化土壤；含鹽量大于0.6%或1.0%為鹽土[5]。在東營市鹽堿地pH為8.09～8.35，鹽度在0.3%～3.0%[14]。因此，文登菌株具有較強(qiáng)的耐鹽能力，為鹽堿地栽培羊肚菌及其育種提供了菌種資源。