王淮 楊健康

【摘要】?目的?通過(guò)對(duì)皮膚黑色素瘤以及正常皮膚的m6A相關(guān)基因的表達(dá)和預(yù)后進(jìn)行分析，探索皮膚黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制。方法?從UCSC Xena上下載TCGA黑色素瘤病人和GTEx正常人皮膚組織的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的23個(gè)m6A相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析;對(duì)表達(dá)有差異的基因使用R語(yǔ)言survival包進(jìn)行生存分析，并得到與預(yù)后關(guān)系最密切的基因;采用GESA分析方法預(yù)測(cè)預(yù)后相關(guān)基因富集的基因集。結(jié)果?表達(dá)分析找到的差異基因共有21個(gè)，其中與預(yù)后關(guān)系最密切的基因只有3個(gè)，分別是IGF2BP1、METTL3和YTHDC2。在GSEA分析中，IGF2BP1、METTL3和YTHDC2主要富集在心臟肌肉收縮、核苷酸切除修復(fù)、RNA降解、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、MTOR信號(hào)通路、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等基因集。結(jié)論?m6A相關(guān)的基因中，IGF2BP1、METTL3和YTHDC2可能通過(guò)多種途徑影響皮膚黑色素瘤的發(fā)生，未來(lái)可能可以作為該疾病的預(yù)后標(biāo)志或潛在治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】?m6A基因;黑色素瘤;表達(dá)差異;生存分析;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：R394.3?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.002

【Abstract】?Objective?To explore the pathogenesis of skin cutaneous melanoma by analyzing the expression and prognosis of m6A-related genes in cutaneous melanoma and normal skin.Methods?RNA expression data of TCGA melanoma tissues and GTEx normal skin tissues were downloaded from UCSC Xena， and 23 m6A-related genes reported in literatures were analyzed for differential expression; survival analysis was carried out on genes with differential expression by using R language survival package， and genes most closely related to prognosis were obtained; GESA analysis method was used to predict the gene sets enriched in prognosis-related genes.Results?A total of 21 differential genes were found by expression analysis， of which only 3 genes were most closely related to prognosis， namely IGF2BP1， METTL3 and YTHDC2. In GSEA analysis， IGF2BP1， METTL3 and YTHDC2 were mainly enriched in gene sets such as cardiac muscle contraction， nucleotide excision repair， RNA degradation， ubiquitin-mediated proteolysis， basic transcription factors， MTOR signaling pathways， non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.Conclusion?Among genes related to m6A， IGF2BP1， METTL3， and YTHDC2 may affect the occurrence of skin cutaneous melanoma through multiple pathways， and may be used as prognostic markers or potential therapeutic targets in the future.

【Key words】?m6A genes; cutaneous melanoma; expression difference; survival analysis; bioinformatics analysis

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，起源于神經(jīng)黑色素細(xì)胞，發(fā)病部位多見(jiàn)于皮膚、黏膜。其中皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）占全身腫瘤的1%，易發(fā)生淋巴結(jié)和血性轉(zhuǎn)移，惡性程度高，病情發(fā)展快，預(yù)后差。因此早期診斷、早期治療對(duì)本病患者起到至關(guān)重要的作用[1～2]。RNA甲基化修飾主要包括N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）、N7-甲基鳥(niǎo)嘌呤（N7-methylguanosine，m7G）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、N1-甲基腺嘌呤（ N1-methyladenosine，m1A）等，其中以m6A最為常見(jiàn)[3]。研究表明，m6A與急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell car-cinoma，CSCC）、乳腺癌（breast cancer）和前列腺癌（prostate cancer，PCa）等多種癌癥密切相關(guān)[4]。m6A是指腺嘌呤（A）的第6位氮原子（N）發(fā)生甲基化修飾，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，可調(diào)節(jié)RNA的剪接、加工、翻譯以及降解等生理過(guò)程，從而影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[5]。本課題組對(duì)m6A相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)差異分析得到與SKCM有關(guān)的m6A相關(guān)基因，繪制每個(gè)相關(guān)基因的生存曲線，探究相關(guān)基因?qū)KCM預(yù)后的影響，并利用基因富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）預(yù)測(cè)相關(guān)基因在SKCM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，旨在探究m6A相關(guān)基因與皮膚黑色素瘤的關(guān)系，為SKCM的早期診斷以及尋找藥物靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1?資料與方法

1.1?數(shù)據(jù)來(lái)源

從UCSC Xena（https：/xenabrowsers.net/）下載得到RNA-seq的FPKM值表達(dá)矩陣，正常皮膚的數(shù)據(jù)來(lái)源于The Genotype-Tissue Expression（GTEx），黑色素瘤數(shù)據(jù)來(lái)源于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）。上述表達(dá)矩陣來(lái)源于Toil流程[6]重新處理的RNA-seq原始數(shù)據(jù)，盡量減少了批次效應(yīng)的影響。最終的合并數(shù)據(jù)集包括469例黑色素瘤樣本和812例正常樣本。

1.2?篩選差異表達(dá)基因

從已發(fā)表過(guò)的文章中收集到m6A相關(guān)的基因[7～9]共有23個(gè)，分別是：YTHDC1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF3、YTHDC2、HNRNPA2B1、YTHDF2、HNRNPC、RBMX、METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、RBM15、RBM15B、FTO、ZC3H13、ALKBH5、PCIF1、CMTR1、CMTR2。從所有基因的表達(dá)矩陣中提取上述23個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。使用R語(yǔ)言limma包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析，以P<0.05為篩選條件。

1.3?基因表達(dá)與SKCM預(yù)后的關(guān)系

使用R語(yǔ)言survival包對(duì)SKCM病人的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析差異表達(dá)基因與生存時(shí)間的關(guān)系，P<0.05說(shuō)明基因與疾病生存率顯著相關(guān)。

1.4?GSEA分析

根據(jù)基因在SKCM組織中的表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用GSEA 3.0軟件對(duì)IGF2BP1、METTL3和YTHDC2的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而發(fā)掘京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因集與SKCM發(fā)生發(fā)展有關(guān)的機(jī)制。按照GSEA默認(rèn)參數(shù)，置換檢驗(yàn)1000次進(jìn)行富集分析，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates， FDR）<0.05的基因集作為顯著富集基因集，最終得到可能受IGF2BP1、METTL3和YTHDC2表達(dá)影響的基因集。

2?結(jié)?果

2.1?差異基因篩選

正常皮膚和黑色素瘤的m6A相關(guān)基因的差異表達(dá)情況，如圖1、圖2所示。根據(jù)結(jié)果顯示，23個(gè)m6A相關(guān)基因中FTO和METTL14的P值分別為0.686和0.938，不具有統(tǒng)計(jì)意義。因此最終得到m6A相關(guān)差異基因共21個(gè)。

2.2?基因表達(dá)與SKCM預(yù)后的關(guān)系

如圖3所示，共3個(gè)基因與SKCM病人的生存時(shí)間相關(guān)，分別是IGF2BP1、METTL3和YTHDC2。根據(jù)結(jié)果，在生存年限相同的條件下，IGF2BP1基因低表達(dá)組的生存率高于高表達(dá)組;METTL3和YTHDC2基因高表達(dá)組的生存率高于低表達(dá)組。故可以初步將IGF2BP1、METTL3和YTHDC2作為評(píng)價(jià)SKCM預(yù)后的因素之一。

2.3?GSEA分析結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1、圖4。根據(jù)GSEA結(jié)果顯示，與生存時(shí)間減少相關(guān)的IGF2BP1高表達(dá)組、METTL3低表達(dá)組以及YTHDC2低表達(dá)組主要富集在心臟肌肉收縮、核苷酸切除修復(fù)、RNA降解、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、MTOR信號(hào)通路、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等基因集。結(jié)果提示IGF2BP1、METTL3和YTHDC2可能通過(guò)影響核苷酸切除修復(fù)、RNA降解以及其他癌癥過(guò)程，從而影響SKCM的發(fā)生發(fā)展。

3?討?論

SKCM全球每年新發(fā)287 723例，死亡60 712例[10]，預(yù)后極差。SKCM的發(fā)病原因還未明確，研究表明m6A對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響[11]，因此通過(guò)生物信息學(xué)分析方法初步推測(cè)m6A在SKCM發(fā)病過(guò)程中的作用。

我們通過(guò)查閱文獻(xiàn)，找到23個(gè)m6A相關(guān)基因，經(jīng)過(guò)表達(dá)差異分析以及對(duì)基因表達(dá)與SKCM預(yù)后的影響分析，最終找到IGF2BP1、METTL3和YTHDC2這3個(gè)與SKCM發(fā)病和預(yù)后相關(guān)基因。

IGF2BP1是胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白家族（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein， IGF2BP）的重要成員之一，屬于結(jié)合蛋白，可以選擇性結(jié)合m6A甲基化修飾的mRNA。IGF2BP參與調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯，細(xì)胞的增殖分化等重要生理過(guò)程[12]。有研究表明，IGF2BP1在多種腫瘤或腫瘤來(lái)源細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在正常組織細(xì)胞中基本不表達(dá)[13]。我們的結(jié)果也顯示正常皮膚組織中IGF2BP1表達(dá)低，而黑色素瘤中表達(dá)上調(diào)且表達(dá)上調(diào)組生存率也較低。根據(jù)GSEA富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1與心肌收縮基因集密切相關(guān)，有可能通過(guò)此途徑影響SKCM的發(fā)生發(fā)展。

甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）屬于甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，對(duì)RNA的m6A甲基化修飾形成起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，METTL3通過(guò)MMP2影響腫瘤的侵襲遷移[14]。我們的結(jié)果顯示METTL3在黑色素瘤中表達(dá)低于正常皮膚，低表達(dá)組生存率低。根據(jù)GSEA富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)METTL3與核苷酸切除修復(fù)、RNA降解、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解等基因集關(guān)系密切，有可能通過(guò)影響這些基因集的功能從而在SKCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白2（YTH domain-containing 2，YTHDC2）也屬于結(jié)合蛋白，能夠調(diào)控m6A位點(diǎn)識(shí)別，YTH蛋白家族的進(jìn)化上保守的YTH結(jié)構(gòu)域可以選擇性識(shí)別m6A[15]。經(jīng)過(guò)分析觀察到Y(jié)THDC2在SKCM組織中低表達(dá)，低表達(dá)組生存率低。根據(jù)GSEA富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)YTHDC2與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、MTOR信號(hào)通路等基因集關(guān)系密切，可能通過(guò)影響它們從而影響SKCM的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過(guò)比較黑色素瘤與正常皮膚組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)得到m6A相關(guān)基因的表達(dá)差異情況，從中篩選出了表達(dá)有差異且與預(yù)后關(guān)系最密切的3個(gè)基因，接著對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行了GSEA基因集富集分析。結(jié)果顯示，IGF2BP1、METTL3和YTHDC2可能通過(guò)影響核苷酸切除修復(fù)、RNA降解、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、MTOR信號(hào)通路等基因集的功能，從而參與SKCM的發(fā)生發(fā)展。這些基因?yàn)镾KCM的診斷以及進(jìn)一步研究SKCM的藥物靶點(diǎn)提供了參考。

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（收稿日期：2020-08-11?修回日期：2020-11-11）

（編輯：梁明佩）