李喬斌，謝曉東，陳 靜，尹德晶，楊 鵬，程振濤，2?，岳 筠

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008)

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(Escherichia coli)引起的多種動物疫病的總稱，不同品種及日齡的雞均可感染，尤其2 ～3 周齡雛雞發(fā)病較嚴重，臨床表現(xiàn)精神沉郁、腹瀉、關(guān)節(jié)腫脹、氣囊炎等癥狀，感染率、死亡率均較高[1，2]。 本試驗通過細菌分離培養(yǎng)、生化試驗、分子生物學鑒定，對貴州省安順市某養(yǎng)雞場發(fā)生疑似大腸桿菌感染病例進行診斷，通過藥物敏感試驗分析分離細菌的耐藥特性，為本病的診斷和臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源貴州省安順市某養(yǎng)雞場的4 只病死雞。

1.2 主要試劑鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染液，均購自北京索萊寶科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 DNA Marker，均購自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extration Kit膠回收試劑盒，購自O(shè)mega 公司；微量生化鑒定管、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細菌分離培養(yǎng)無菌取病死雞的肝臟、脾臟，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，對分離細菌進行純培養(yǎng)。

1.4 形態(tài)學觀察觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；純化細菌革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)。

1.5 生化實驗將純化培養(yǎng)的分離菌接種到17 種微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.6 分子生物學鑒定

1.6.1 16S rDNA PCR 擴增采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌DNA 為模板，用細菌16S rDNA 的通用引物(F：5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAC-3’；R：5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行 PCR 擴增。 PCR 擴增體系 25 μL： 模板2 μL，上、下游引物各 1 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。 擴增程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 90 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 膠回收目的基因由華大基因有限公司測序。

1.6.2 基因序列分析將分離菌的16S rDNA 基因測序結(jié)果與GenBank 中的大腸桿菌菌株進行同源性比對，確定分離菌株的種屬。

1.7 藥敏實驗采用紙片法進行10 種藥物的敏感性試驗：將純化細菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分別貼上各藥物紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測量并記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及細菌形態(tài)特征在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出圓滑、凸起、半透明的灰白色菌落(見圖1A)；在麥康凱培養(yǎng)基上生長出紅色菌落(圖1B)；分離菌革蘭氏染色，顯微鏡下觀察呈紅色、短小桿狀、兩端鈍圓、著色較深的革蘭氏陰性桿菌(見圖1C)。

2.2 生化特性分離菌能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露糖；賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶均為陰性；吲哚、甲基紅試驗均為陽性，V-P、枸櫞酸鹽試驗均為陰性；不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，不利用丙肌醇。生化鑒定結(jié)果與大腸桿菌的生化特性相符。

2.3 分子生物學鑒定結(jié)果

2.3.1 16S rDNA PCR 擴增由圖2 可見，擴增獲得1 408 bp 基因片段，與預期大小一致。

2.3.2 基因序列分析由圖3 可見，分離菌(Escherichia coliGZ1)16S rDNA 基因測序片段與GenBank中已知的15 株大腸桿菌菌株同源性均在99%以上，因此確定分離菌為大腸桿菌，命名為：EscGZ 2019-05。

2.4 藥物敏感性分離細菌對安普霉素、泰妙菌素、多西環(huán)素等藥物較敏感；對替米考星、泰萬菌素、磺胺間甲氧嘧啶、泰樂菌素、阿莫西林不敏感。 見表1。

表1 分離細菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

3.1 雞大腸桿菌病是1 種比較常見的多發(fā)病，對養(yǎng)雞業(yè)危害較大[3]。 本病因飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境衛(wèi)生、防治措施、有無繼發(fā)其他疫病等因素的影響，發(fā)病率和死亡率有較大差異[4]。 許多集約化養(yǎng)雞場由于只重視重大病毒性疫病的免疫和防控，大腸桿菌病的發(fā)病率有明顯的上升趨勢，已成為危害雞群的主要細菌性疾病之一，應引起足夠重視[5]。 本次病例也證實雞大腸桿菌病在貴州省養(yǎng)雞場中存在。

3.2 對細菌病的實驗室診斷一般通過細菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察和生化試驗等作出細菌種類的分析[6～9]。 在宏觀上具有快速鑒別診斷的優(yōu)勢，但不能區(qū)分細菌的不同種屬。 本試驗在傳統(tǒng)細菌分離鑒定的基礎(chǔ)上，通過對菌株16S rDNA 的基因擴增和克隆測序，對病原的確定更加準確。

3.3 由于抗生素的廣泛使用，許多細菌產(chǎn)生耐藥性，因此對致病菌的耐藥性進行確定尤為重要[10]。本次分離的大腸桿菌對替米考星、泰萬菌素、磺胺間甲氧嘧啶、泰樂菌素、阿莫西林具有耐藥性，與尹姣姣等[11]分離的菌株藥敏實驗結(jié)果相比，均對阿莫西林具有耐藥性，而對其他藥物的耐藥性各不相同，說明各地區(qū)的分離菌株耐藥性具有較為明顯的差別，且耐藥情況均較普遍。 選擇藥物時應根據(jù)藥敏試驗結(jié)果篩選最敏感的藥物和最合適的劑量，切忌濫用、亂用，否則耐藥情況很可能進一步加重[12]。