張孟珂，王知力，劉愿，何艷

解放軍總醫(yī)院超聲診斷科，北京 100853；*通訊作者 王知力 wzllg@sina.com

乳腺癌居我國(guó)女性惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害女性健康。乳腺癌早期診斷的5年生存率可達(dá)95%[1]，因而早期診斷成為迫切需求。多項(xiàng)研究表明，剪切波彈性成像在乳腺病變良、惡性鑒別診斷中發(fā)揮重要作用[2-3]；前期研究亦表明，乳腺良、惡性病變的彈性模量值存在差異，且彈性模量值與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的膠原纖維、彈性纖維含量等密切相關(guān)[4-5]，證實(shí)ECM 在調(diào)控乳腺病變彈性特征的過程中發(fā)揮重要作用。而ECM 成分及結(jié)構(gòu)的變化主要是由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）調(diào)控，TGF-β1的異常表達(dá)可促進(jìn)ECM 中膠原蛋白及纖維蛋白過度沉積，并抑制ECM的降解[6-7]，造成ECM 硬度增加。因此，TGF-β1、ECM、彈性特征之間存在著密切聯(lián)系。然而，TGF-β1與乳腺病變的彈性特征是否具有相關(guān)性目前鮮有報(bào)道。本研究擬探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1與乳腺病變彈性特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年4—10月于解放軍總醫(yī)院超聲診斷科接受超聲引導(dǎo)下穿刺活檢、旋切活檢或手術(shù)切除的130例女性患者共135個(gè)乳腺病變，患者年齡18～73歲，平均（44±12）歲；病變最大徑0.4～5.5 cm，平均（1.6±0.8）cm。所有病變?cè)谶M(jìn)行活檢或手術(shù)切除前均進(jìn)行剪切波彈性成像檢查，并以病理結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入患者均簽訂書面知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷結(jié)果明確；②未接受過新輔助化療或放療；③穿刺活檢、旋切活檢或手術(shù)切除；④臨床、病理及預(yù)后隨訪信息全面；⑤簽訂書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過新輔助化療或放療者；②臨床、病理及預(yù)后隨訪信息缺失者。

1.2 剪切波彈性成像 采用SuperSonic Imagine 公司的AixPlorer 實(shí)時(shí)剪切波彈性成像超聲診斷儀，使用L15-4線陣探頭，探頭頻率為4～15 MHz。首先在病變處行常規(guī)超聲檢查，然后轉(zhuǎn)換成剪切波彈性成像模式，探頭與皮膚保持垂直緩慢平穩(wěn)移動(dòng)以尋找病灶，于病灶處不施壓靜置3 s 使圖像穩(wěn)定后，凍結(jié)并存儲(chǔ)圖像，繼而使用機(jī)器自配的定量測(cè)量軟件選取感興趣區(qū)測(cè)量彈性值。選取感興趣區(qū)時(shí)應(yīng)使取樣框盡可能覆蓋整個(gè)病灶大小，尤其是最硬的區(qū)域。于病灶的3個(gè)不同切面定位測(cè)量，分別記錄最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值，并測(cè)量取樣框所置病灶處與周圍同等深度正常乳腺組織的彈性模量比值，計(jì)算這3組數(shù)據(jù)中最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值的均值，并記錄病變邊緣有無“硬環(huán)征”現(xiàn)象出現(xiàn)。

1.3 TGF-β1 檢測(cè) 病變組織經(jīng)福爾馬林固定及石蠟 包埋后切成4 μm 厚的切片，然后采用免疫組化法檢測(cè)TGF-β1。免疫組化染色結(jié)果使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。每張切片于400 倍視野下取5個(gè)感興趣區(qū)并拍照，測(cè)量集成光密度及面積，計(jì)算平均光密度（集成光密度/面積），用平均光密度評(píng)價(jià)TGF-β1的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件，計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較乳腺良、惡性病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值、TGF-β1表達(dá)水平及有無“硬環(huán)征”的病變TGF-β1表達(dá)水平等的差異；采用χ2檢驗(yàn)比較良、惡性病變“硬環(huán)征”的發(fā)生率；以病理結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值、TGF-β1 水平、“硬環(huán)征”等分別繪制受試者工作特征（ROC）曲線，以曲線下面積（AUC）評(píng)估其對(duì)乳腺病變良惡性的鑒別診斷效能，并分析截?cái)嘀?、敏感度、特異度，采用Z檢驗(yàn)比較各AUC 之間的差異；采用Pearson 相關(guān)分析評(píng)估TGF-β1表達(dá)水平與乳腺病變彈性參數(shù)的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺病變病理結(jié)果 135個(gè)乳腺病變中，病理結(jié)果顯示良性84個(gè)（62.2%），其中纖維腺瘤32個(gè)，腺病40個(gè)，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤3個(gè)，炎性病變8個(gè)，良性葉狀腫瘤1個(gè)；惡性51個(gè)（37.8%），其中浸潤(rùn)性癌46個(gè)，導(dǎo)管內(nèi)癌3個(gè)，黏液癌2個(gè)。

2.2 乳腺良、惡性病變彈性特征分析 乳腺惡性病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值及與周圍組織彈性比值明顯高于乳腺良性病變（P<0.001），但良、惡性病變的最小彈性模量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；74.5%（38/51）的乳腺惡性病變具有“硬環(huán)征”表現(xiàn)，顯著高于乳腺良性病變（4.8%，4/84；P<0.001），見表1及圖1、2。最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值及“硬環(huán)征”對(duì)乳腺良、惡性病變均具有很好的鑒別診斷效能，四者鑒別診斷效能比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05；圖3，表2）。

2.3 TGF-β1表達(dá)水平及與彈性特征的相關(guān)性 135個(gè)乳腺病變的TGF-β1表達(dá)水平為0.176±0.126，乳腺惡性病變的TGF-β1表達(dá)水平顯著高于乳腺良性病變（0.299±0.011比0.104±0.009，P<0.001），見圖1B、2B及表1。以TGF-β1表達(dá)水平對(duì)乳腺良、惡性病變進(jìn)行鑒別診斷，其效能為0.934（0.878～0.970），以平均光密度=0.222為截?cái)嘀禃r(shí)，鑒別診斷乳腺病變良惡性的敏感度、特異度分別為88.2%、89.3%（圖3，表2）。TGF-β1表達(dá)水平與乳腺病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值呈強(qiáng)正相關(guān)（r=0.879、0.821、0.741，P<0.001；圖4）。此外，表現(xiàn)為“硬環(huán)征”的乳腺病變TGF-β1表達(dá)水平顯著高于無“硬環(huán)征”的乳腺病變（0.308±0.010比0.115±0.010，P<0.001）。

表1 乳腺良、惡性病灶的彈性特征及TGF-β1表達(dá)水平（±s）

表1 乳腺良、惡性病灶的彈性特征及TGF-β1表達(dá)水平（±s）

指標(biāo) 良性病灶（n=84） 惡性病變（n=51） t/χ2值 P值 最大彈性模量值（kPa） 58.2±50.5 161.9±79.5 9.276 ＜0.001 ＜0.001 最小彈性模量值（kPa） 15.4±12.9 20.6±19.5 1.434 0.154 平均彈性模量值（kPa） 35.9±26.4 99.6±51.9 9.433 ＜0.001 “硬環(huán)征”[例（%）]4（4.8） 38（74.5） 72.030 ＜0.001 病變與周圍組織彈性比值 2.1±1.7 6.0±4.1 7.625 TGF-β1表達(dá)水平 0.104±0.009 0.299±0.011 13.301 ＜0.001

圖1 女，29歲，乳腺浸潤(rùn)性癌。剪切波彈性成像示彈性模量最大值為233.2 kPa，平均值為137.4 kPa，病變與周圍組織彈性比值為6.9，可見“硬環(huán)征”（箭）出現(xiàn)（A）；免疫組化染色示TGF-β1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，平均光密度為0.314（×400，B）

圖2 女，26歲，乳腺纖維腺瘤。剪切波彈性成像示彈性模量最大值為19.6 kPa，平均值為15.8 kPa，病變與周圍組織彈性比值為0.7（A）；免疫組化染色示TGF-β1表達(dá)呈弱陽(yáng)性，平均光密度為0.037（×400，B）

圖3 病變的彈性特征及TGF-β1 鑒別診斷乳腺良、惡性病變的ROC曲線

圖4 TGF-β1表達(dá)水平與病變彈性特征的相關(guān)性。A、B、C 分別為TGF-β1表達(dá)水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值的相關(guān)性（r=0.879、0.821、0.741）

3 討論

乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是有效治療的關(guān)鍵。目前，剪切波彈性成像在乳腺病變?cè)\斷中的重要作用已得到證實(shí)[8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，ECM 中的膠原蛋白及彈性蛋白是決定病變彈性的重要因素[4,10]，乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中伴隨著ECM 成分及結(jié)構(gòu)的異常變化[11]，而TGF-β1 作為調(diào)節(jié)ECM 變化的主要因素，其與乳腺病變的彈性特征是否相關(guān)目前較少研究。

本研究表明，乳腺惡性病變的最大彈性模量值、平均彈性模值、病變與周圍組織彈性比值顯著高于良性病變，與既往研究一致[3,12]。這可能是因?yàn)槿橄賽盒圆∽冊(cè)谏L(zhǎng)過程中癌細(xì)胞無限增殖，且不斷向周圍侵襲乳腺間質(zhì)及脂肪組織，導(dǎo)致復(fù)雜的ECM 反應(yīng)，進(jìn)而引起復(fù)雜的結(jié)締組織增生及纖維化反應(yīng)，導(dǎo)致病變硬度增加[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值及“硬環(huán)征”均具有很好的鑒別診斷乳腺病變良惡性的效能，進(jìn)一步證實(shí)剪切波彈性成像在診斷乳腺病變中具有重要價(jià)值。

TGF-β1 作為TGF-β 超家族中的一員，廣泛分布于人體內(nèi)，可調(diào)控組織及器官纖維化、細(xì)胞癌變、細(xì)胞增殖等多個(gè)過程，作用顯著[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺惡性病變的TGF-β1表達(dá)水平顯著高于良性病變，這可能是由于惡性病灶在生長(zhǎng)過程中癌細(xì)胞大量增殖使得TGF-β1 大量活化，TGF-β1表達(dá)水平亦大幅提升，而大量表達(dá)的TGF-β1 又反過來影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其轉(zhuǎn)變成與形成癌癥相關(guān)的肌成纖維細(xì)胞[16-17]，加快病灶生長(zhǎng)，從而使TGF-β1表達(dá)水平進(jìn)一步升高。本研究結(jié)果還表明TGF-β1 對(duì)乳腺良、惡性病變的鑒別診斷效能較佳，提示TGF-β1可能是乳腺癌鑒別診斷的一個(gè)新的切入點(diǎn)，為診斷乳腺病變提供新思路。

既往研究表明，乳腺癌病灶生長(zhǎng)過程中大量表達(dá)的TGF-β1 一方面可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)膠原蛋白、纖維蛋白等的合成及分泌，從而導(dǎo)致ECM 成分的過度堆積[6,16]，造成ECM 硬度增加；另一方面還可刺激膠原蛋白、彈性蛋白、粘連蛋白等ECM 主要成分的合成及交聯(lián)重排，并抑制其降解，導(dǎo)致ECM 硬度增加[14,18]，從而使病變“變硬”。此外，TGF-β1 亦可通過促進(jìn)癌細(xì)胞合成并分泌多種蛋白酶類，提高細(xì)胞黏附性，使得癌細(xì)胞與周圍乳腺間質(zhì)及脂肪組織粘連，導(dǎo)致病變活動(dòng)性降低，增加病變硬度[19]。本研究顯示，TGF-β1表達(dá)水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值均呈強(qiáng)正相關(guān)，提示TGF-β1 對(duì)乳腺病變的硬度有一定的調(diào)控作用。

Insana 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞在不斷向周圍侵襲乳腺間質(zhì)及脂肪組織導(dǎo)致結(jié)締組織增生及纖維化反應(yīng)時(shí)，TGF-β1 亦不斷誘導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并促使其不斷向病灶生長(zhǎng)的邊緣生長(zhǎng)，根據(jù)膠原纖維、彈性纖維堆積程度和數(shù)目及纖維化反應(yīng)程度，病灶對(duì)其周圍組織施予不同程度的拉力[21]。而彈性蛋白和纖維蛋白在拉伸狀態(tài)下會(huì)變硬[22]，從而使得病灶周圍組織的硬度增加2～10 倍，因而造成“硬環(huán)征”的出現(xiàn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變“硬環(huán)征”的發(fā)生率高于良性病變，且具有“硬環(huán)征”的乳腺病變TGF-β1表達(dá)水平顯著高于無“硬環(huán)征”的病變，提示TGF-β1與“硬環(huán)征”具有相關(guān)性。

總之，乳腺病變的TGF-β1表達(dá)水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值、“硬環(huán)征”等均具有相關(guān)性，提示TGF-β1可能在乳腺病變彈性特征的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。