2020年1月13日，Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了來自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組和李家洋課題組合作題為“Targeted， random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors”的研究論文。

該研究設(shè)計(jì)了可以從頭突變并促進(jìn)植物基因的定向進(jìn)化的基因編輯器STEME-1和第二代STEME-NG。該研究利用這兩個(gè)編輯器定向進(jìn)化水稻OsACC基因并獲得除草劑抗性突變。因此，這兩個(gè)STEME將加快植物及作物的性狀發(fā)展與進(jìn)化，為快速獲得有益農(nóng)藝性狀提供了可能，對(duì)農(nóng)作物分子設(shè)計(jì)育種具有重要意義。該研究得到中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項(xiàng)、國家自然基金委等項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)資助。

構(gòu)建新型飽和靶向內(nèi)源基因突變堿基編輯器STEME，并在植物中實(shí)現(xiàn)了基因的定向進(jìn)化和功能篩選

遺傳和變異是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。長期以來，通過物理（例如紫外線）或化學(xué)（例如甲烷磺酸乙酯）方法進(jìn)行隨機(jī)誘變可改善植物的性狀，但勞動(dòng)強(qiáng)度大且耗時(shí)。定向進(jìn)化（Directed Evolution）則通過創(chuàng)制目標(biāo)基因的突變文庫，在施加一定選擇壓力下能夠快速獲得目的突變體。目前，植物基因的定向進(jìn)化通常先通過易錯(cuò)PCR、DNA合成或DNA重組等方法在體外產(chǎn)生目標(biāo)基因的突變文庫，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或酵母中進(jìn)行功能篩選。然而，由于離開原始的基因組和細(xì)胞環(huán)境，篩選出來的基因突變可能并不能完全反映出它在植物中的真實(shí)功能。更重要的是，大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀無法在大腸桿菌或酵母中進(jìn)行篩選。因此，建立一種在植物原位進(jìn)行基因飽和突變和功能篩選的定向進(jìn)化新方法將有助于加快植物育種及重要功能基因研究的進(jìn)程。

應(yīng)用STEME-1和STEME-NG在水稻中定向進(jìn)化OsACC基因獲得了除草劑抗性突變

研究者將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時(shí)融合在nCas9 （D10A）的N端，并將抑制體內(nèi)尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表達(dá)的形式置于nCas9 （D10A）的C端，共構(gòu)建了4種形式的雙堿基編輯器STEME （STEME-1至STEME-4）。STEME雙堿基編輯器均可以只在一個(gè)sgRNA引導(dǎo)下就可以誘導(dǎo)靶位點(diǎn)C>T和A>G的同時(shí)突變，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及產(chǎn)生突變類型的多樣性。STEME-1在水稻原生質(zhì)體中C>T誘導(dǎo)效率高達(dá)61.61%，C>T和A>G同時(shí)突變的效率也高達(dá)15.50%。為了提高靶基因的堿基覆蓋度，研究者進(jìn)一步利用能夠識(shí)別NG PAM的變體Cas9-NG構(gòu)建了第5個(gè)雙堿基編輯器STEME-NG，發(fā)現(xiàn)只需要20個(gè)sgRNA就可以對(duì)OsACC上編碼56個(gè)氨基酸的序列實(shí)現(xiàn)近飽和的突變。

為了展示STEME在植物中的定向進(jìn)化能力，研究者設(shè)計(jì)了靶向OsACC羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域上400個(gè)氨基酸編碼序列的200個(gè)獨(dú)立的sgRNA，分別構(gòu)建到STEME-1或STEME-NG雙元載體上。將構(gòu)建好的雙元載體分為27個(gè)轉(zhuǎn)化組，每個(gè)組內(nèi)混合了等分子量的4至11個(gè)sgRNA載體，覆蓋80-142 bp的靶DNA區(qū)域，便于提高轉(zhuǎn)化效率和突變的高通量測(cè)序。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷，共獲得約6000株水稻再生苗。水培法煉苗10天后，對(duì)再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）進(jìn)行篩選，共發(fā)現(xiàn)四個(gè)除草劑抗性突變位點(diǎn)：P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外，其余三個(gè)抗性位點(diǎn)未曾在植物中有過報(bào)道。其中，P1927F與W2125C突變一樣表現(xiàn)出強(qiáng)除草劑抗性，具有較高的生產(chǎn)應(yīng)用潛能?；谕吹鞍捉Y(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸突變直接或間接地影響了除草劑結(jié)合口袋的構(gòu)象，從而降低了其對(duì)除草劑分子的結(jié)合能力而獲得除草劑抗性。

此外，STEME系統(tǒng)還有望應(yīng)用于不同細(xì)胞系、酵母或動(dòng)物中的非編碼區(qū)的順式作用元件的調(diào)控、動(dòng)物致病SNV的修正和抗藥位點(diǎn)的篩選等。

來源：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、國科農(nóng)研院