李 磊，周文豪，蔡林森，魯康樂(lè)，張春曉

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

魚類營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝病是養(yǎng)殖魚類最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)代謝疾病，其特征為肝臟內(nèi)脂肪沉積過(guò)多、病魚生長(zhǎng)緩慢、飼料系數(shù)升高、抗應(yīng)激能力下降，當(dāng)遭受高溫、高氨氮等環(huán)境應(yīng)激時(shí)會(huì)導(dǎo)致群體死亡，嚴(yán)重影響魚類養(yǎng)殖的健康可持續(xù)發(fā)展[1-2]。雖然，產(chǎn)業(yè)界進(jìn)行了多年的防控實(shí)踐，但因?qū)ζ浒l(fā)生機(jī)制缺乏深入了解，不能有效防止其發(fā)生。因此，開(kāi)展魚類營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝發(fā)生機(jī)制及調(diào)控的研究較為迫切。

為研究魚類脂肪肝的發(fā)生機(jī)制，眾多學(xué)者運(yùn)用動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型開(kāi)展相關(guān)研究。細(xì)胞模型具有條件可控、實(shí)驗(yàn)周期短、干擾因素少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于脂肪肝的研究[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立肝細(xì)胞脂肪沉積模型，為研究魚類脂肪肝的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)材料?；|是一種海水肉食性魚類，因味道鮮美而被廣泛養(yǎng)殖，其年產(chǎn)量位居全國(guó)海水魚產(chǎn)量第3位，但在養(yǎng)殖過(guò)程中易發(fā)脂肪肝，這是限制其健康養(yǎng)殖的主要因素之一[4-5]。目前對(duì)花鱸脂肪肝的研究較少，其體外細(xì)胞模型尚未見(jiàn)報(bào)道。相比體外細(xì)胞模型，活體脂肪肝模型因?qū)嶒?yàn)周期長(zhǎng)、干擾因素多等原因，使研究存在一定的困難。為此，參考哺乳動(dòng)物的體外細(xì)胞模型的方法，本研究將采用油酸誘導(dǎo)的方法建立花鱸原代肝細(xì)胞脂肪沉積模型，為后期研究花鱸的脂肪肝發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)材料。

二甲雙胍，為一種醫(yī)學(xué)上最廣泛使用的降脂藥物[6]。有研究表明，二甲雙胍對(duì)哺乳動(dòng)物的脂肪肝有一定的治療作用[7-8]，但二甲雙胍對(duì)魚類脂肪肝是否有緩解作用尚不得而知。本實(shí)驗(yàn)將探討二甲雙胍對(duì)魚類脂肪肝的緩解作用，以期為魚類脂肪肝的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚：體重約為50 g的健康花鱸。

實(shí)驗(yàn)試劑：L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS溶液、青鏈霉素混合液，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；油酸(oleic acid，OA)購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2 花鱸原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下于超凈工作臺(tái)內(nèi)取花鱸肝臟，用75%(體積分?jǐn)?shù))醫(yī)用酒精浸泡滅菌30 s，取出放置于10 mL離心管內(nèi)，加入含1%(體積分?jǐn)?shù))青鏈霉素混合液的PBS緩沖液，用滅菌手術(shù)剪剪碎至1 mm大小，再用PBS緩沖液清洗三次，至上清液澄清；加入0.25%(體積分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶，充分吹打，于室溫下消化10～15 min；過(guò)100目細(xì)胞過(guò)濾篩，1500 r/min離心5 min，棄上清；再加入紅細(xì)胞裂解液裂解7 min，1000 r/min離心4 min，棄上清，若還有紅細(xì)胞殘留，則重復(fù)此步驟；然后加入含15%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的L-15培養(yǎng)基重懸，按細(xì)胞懸液與60%(體積分?jǐn)?shù))percoll分離液1∶2(體積比)進(jìn)行分離，4 ℃,5000 r/min離心3 min，棄上清；用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種密度為1×106mL-1。計(jì)數(shù)結(jié)束后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，于25 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3 不同油酸濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)原代肝細(xì)胞

將花鱸肝細(xì)胞接種于12孔板上，將其分為4個(gè)濃度處理組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的油酸(0、0.2、0.4、0.8 mmol/L，油酸濃度參考文獻(xiàn)[9])，分別培養(yǎng)細(xì)胞24，48 h。培養(yǎng)前先將油酸與NaOH溶液進(jìn)行皂化以生成油酸鈉，然后按設(shè)定濃度添加到各組培養(yǎng)基中。

1.4 肝細(xì)胞存活率測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后，向每個(gè)孔內(nèi)加入50 μL 5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h，隨后棄上清，每孔加入DMSO溶液150 μL，于平板搖床上搖勻，使其形成均一的藍(lán)色溶液，測(cè)定其在570 nm波長(zhǎng)的吸光度值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率(%)=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

1.5 肝細(xì)胞脂肪沉積與生化指標(biāo)的分析

油紅O染色：將油酸處理24、48 h后的細(xì)胞移除掉培養(yǎng)基，先用PBS清洗兩次，再用ORO Fixative固定液固定30 min；棄去固定液，用蒸餾水浸洗兩次，加入60%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇浸洗5 min；棄去異丙醇，加入新配制的ORO Stain，浸染20 min；棄去染液，水洗三次，直至無(wú)多余染液；加入Mayer蘇木素染色液，復(fù)染核1～2 min；棄去染液后水洗2～5次；加入ORO Buffer 1 min，棄去；加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察。

上清液AST、ALT與LDH的測(cè)定：將細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液收集在離心管中，置于離心機(jī)中以1000 r/min的轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心10 min，得到上清液，然后參照南京建成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

肝細(xì)胞TG與TC含量的測(cè)定：吸去上清液之后，使用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗板底2～3次，然后可以使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞直接刮下來(lái)，或者用0.25%(體積分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶室溫消化5 min左右，加含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，用槍頭輕輕吹打使細(xì)胞脫落，再將所有液體吸出轉(zhuǎn)移至離心管后，1000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上清留細(xì)胞沉淀，使用適量預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，以同樣的條件再次離心，棄上清保留沉淀待用。TG與TC含量的測(cè)定參照南京建成試劑盒說(shuō)明書。

1.6 二甲雙胍對(duì)肝細(xì)胞脂肪沉積的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理組：對(duì)照組、油酸組、二甲雙胍組。對(duì)照組：用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)花鱸原代肝細(xì)胞；油酸組：在正常培養(yǎng)基中加入0.4 mmol/L油酸(此濃度根據(jù)1.3部分篩選)；二甲雙胍組：在油酸組的基礎(chǔ)上加入0.2 mmol/L的二甲雙胍(據(jù)前期研究，此濃度為對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害作用的最高濃度)。培養(yǎng)肝細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA Ducan)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基油酸濃度對(duì)原代肝細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果如表1所示，培養(yǎng)基油酸的不同濃度顯著影響肝細(xì)胞存活率。培養(yǎng)24 h后，隨油酸濃度的升高，肝細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)油酸濃度為0.4 mmol/L時(shí)，存活率為84%；當(dāng)油酸濃度為0.8 mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率只有41%，顯著低于其他各組。培養(yǎng)48 h后， 0.4和0.8 mmol/L油酸組的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低。

表1 培養(yǎng)基油酸濃度對(duì)原代肝細(xì)胞存活率的影響

說(shuō)明：同一行上標(biāo)間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：In the same row,values with different letter superscripts mean significant differences(P<0.05).

2.2 培養(yǎng)基油酸濃度對(duì)原代肝細(xì)胞脂肪含量的影響

由表2可知：經(jīng)不同濃度的油酸處理后，肝細(xì)胞內(nèi)的TG和TC含量都有不同程度上升；油酸濃度為0.4 mmol/L時(shí)，培養(yǎng)24，48 h后，細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量均顯著高于其他各組，說(shuō)明0.4 mmol/L的油酸濃度能夠誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞的脂肪沉積。

表2 培養(yǎng)基油酸濃度對(duì)原代肝細(xì)胞甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)含量的影響

說(shuō)明：表格中同行上標(biāo)間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：In the same row,values with different letter superscripts mean significant differences(P<0.05).

2.3 上清液中AST、ALT與LDH活性

由表3可知：經(jīng)不同濃度的油酸處理后，上清液的AST、ALT與LDH活性(z)都有不同程度上升。油酸濃度為0.4 mmol/L時(shí)，培養(yǎng)24，48 h后，上清液的AST、ALT活性均顯著高于其他各組，說(shuō)明這一處理的肝細(xì)胞損傷較嚴(yán)重；而上清液LDH活性，油酸0.2 mmol/L組顯著高于其他各組。

表3 培養(yǎng)基油酸濃度對(duì)上清液中AST、ALT和LDH活性的影響

說(shuō)明：表格中同行上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：In the same row,values with different letter superscripts mean significant differences(P<0.05).

2.4 二甲雙胍對(duì)花鱸原代肝細(xì)胞脂肪沉積的影響

由表4可知：與對(duì)照組相比，油酸組TG、TC含量均有不同程度升高，AST、ALT、LDH活性上升；二甲雙胍組相比高脂組，其各項(xiàng)數(shù)據(jù)均下降。由此可見(jiàn)，二甲雙胍可緩解由油酸引起的肝細(xì)胞脂肪沉積與肝細(xì)胞損傷。

表4 二甲雙胍對(duì)肝細(xì)胞脂肪沉積的影響

說(shuō)明：同行上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：In the same row,values with different letter superscripts mean significant differences(P<0.05).

2.5 花鱸原代肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

如圖1a所示，用胰蛋白酶消化法分離的原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，剛消化下來(lái)的細(xì)胞形態(tài)圓潤(rùn)，單個(gè)散在分布，呈透明球形。接種后6 h開(kāi)始貼壁，24 h后基本全部貼壁，少數(shù)未貼壁細(xì)胞為消化過(guò)度而死亡的細(xì)胞。48 h后，細(xì)胞變形顯著、代謝旺盛、活力強(qiáng)，貼壁后的細(xì)胞相互聯(lián)結(jié)，細(xì)胞扁平呈鋪路石樣(見(jiàn)圖1b)。此外，油紅O染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量脂滴，用0.4 mmol/L油酸培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)顯著增加，肝細(xì)胞脂肪滴沉積較多(見(jiàn)圖2b)。

3 討論

魚類脂肪肝給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10-11]，但目前因?qū)Πl(fā)生機(jī)制缺乏了解而不能有效遏制其發(fā)生。為了準(zhǔn)確、方便地研究脂肪肝的發(fā)生機(jī)制，合適的實(shí)驗(yàn)材料不可或缺，因此本實(shí)驗(yàn)以花鱸原代肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料來(lái)構(gòu)建肝細(xì)胞脂肪過(guò)度沉積模型，可以模擬在體魚類肝臟脂肪沉積，使實(shí)驗(yàn)材料獲取便利，同時(shí)縮短篩選抗脂肪物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)周期。已有科研工作者使用酒精、化學(xué)藥物、脂肪乳等成功構(gòu)建了肝細(xì)胞脂肪過(guò)度沉積模型[3,12-14]。因魚類脂肪肝發(fā)生的主要原因是脂肪攝入過(guò)多，本研究用油酸作用于花鱸肝細(xì)胞，能更好地模擬實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中的脂肪沉積現(xiàn)象。

本研究設(shè)置不同濃度油酸(0，0.2，0.4，0.8 mmol/L)與花鱸原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)24，48 h，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪沉積。從脂肪沉積的效果看：油酸濃度為0～0.4 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，脂肪沉積隨油酸濃度升高而升高，但當(dāng)油酸濃度為0.8 mmol/L時(shí)，脂肪沉積反而會(huì)較0.4 mmol/L時(shí)低，這可能是由于過(guò)高的油酸濃度會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡或死亡增多，或者負(fù)反饋而抑制脂肪的吸收。本實(shí)驗(yàn)中的肝細(xì)胞存活率也進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)，當(dāng)油酸濃度為0.8 mmol/L時(shí)，肝細(xì)胞的存活率會(huì)顯著低于其他各組。綜合細(xì)胞存活率和脂肪沉積的指標(biāo)，當(dāng)油酸濃度為0.4 mmol/L時(shí)，比較適合構(gòu)建花鱸原代肝細(xì)胞脂肪沉積模型。此外，對(duì)肝細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)48 h后，肝細(xì)胞變形增多，細(xì)胞呈島狀，比較符合原代肝細(xì)胞特征，且細(xì)胞存活率大于60%，能夠達(dá)到細(xì)胞收集的要求。因此，油酸濃度為0.4 mmol/L培養(yǎng)48 h的肝細(xì)胞比較適合作為研究花鱸肝細(xì)胞脂肪沉積的體外模型的實(shí)驗(yàn)材料。

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是臨床上常被用來(lái)判定肝臟是否損傷的經(jīng)典指標(biāo)，在肝炎、脂肪肝等疾病測(cè)定時(shí)均有重要的指示意義，這兩種轉(zhuǎn)氨酶在血清中活性的升高，常作為肝臟功能異常的依據(jù)[15-17]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了上清液中AST、ALT的活性，在培養(yǎng)24 h后，各濃度油酸組的轉(zhuǎn)氨酶活性均高于對(duì)照組，說(shuō)明肝細(xì)胞已經(jīng)受到了損傷，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶釋放到上清液中，這也與用高脂飼料投喂魚體會(huì)導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶活性增高的現(xiàn)象一致[18]。此外，乳酸脫氫酶(LDH)是廣泛存在于肝、腎等組織中的酶，任何原因?qū)е碌母渭?xì)胞損傷都可以導(dǎo)致LDH從胞質(zhì)內(nèi)逸出，導(dǎo)致培養(yǎng)液中的LDH含量升高[19-20]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各油酸組LDH活性均高于對(duì)照組，也證實(shí)了油酸培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷，而這種損傷正是由于脂肪過(guò)度沉積導(dǎo)致的，與活體養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)相似。且0.2 mmol/L油酸組上清液中LDH活性最高，顯著高于其他各組。低濃度油酸組反而會(huì)比高濃度油酸組LDH活性高的原因在于，高濃度的油酸組有較低的細(xì)胞存活率，細(xì)胞數(shù)量少了使所產(chǎn)生LDH的量也會(huì)減少，因此上清液中活性會(huì)低。

二甲雙胍是一種經(jīng)典的降脂藥物，它通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物I和線粒體的氧化磷酸化，激活A(yù)MPK途徑，促進(jìn)脂肪酸進(jìn)行β氧化，減少脂肪合成，從而達(dá)到對(duì)脂肪代謝的改善作用[21-23]。本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步探究魚類脂肪肝的防治方法，也選用了二甲雙胍，研究其對(duì)肝細(xì)胞脂肪沉積的改善作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍對(duì)油酸誘導(dǎo)的花鱸肝細(xì)胞脂肪沉積模型有緩解作用，可作為魚類脂肪肝防治的藥物之一。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用油酸誘導(dǎo)法建立了花鱸肝細(xì)胞脂肪沉積模型，當(dāng)油酸濃度為0.4 mmol/L，與肝細(xì)胞培養(yǎng)48 h，肝細(xì)胞脂肪沉積嚴(yán)重，與活體呈現(xiàn)相同的脂肪肝癥狀。這為研究花鱸的脂肪肝發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)材料。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能緩解肝細(xì)胞脂肪沉積，為魚類脂肪肝的防治提供了理論基礎(chǔ)。