王媛媛, 王繼巖, 焉 莉, 高 強(qiáng), 韓 旭

(1.吉林省商品糧基地土壤資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130118; 2.生態(tài)環(huán)境部環(huán)境規(guī)劃院總量控制與排放交易研究中心 北京 100000)

土壤是植物賴(lài)以生存的基礎(chǔ)，土壤微生物對(duì)外界的感知能力極為敏感，不僅是評(píng)價(jià)土壤肥力的主要指標(biāo)，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成。土壤微生物群落反映的土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)變化是判定土壤的性質(zhì)和生態(tài)功能的重要指標(biāo)[1]。真菌是土壤中的主要分解者之一，對(duì)外界變化更為敏感、直觀，可以通過(guò)調(diào)節(jié)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的周轉(zhuǎn)，影響?zhàn)B分資源的分配和化學(xué)組成[2]。同時(shí)，土壤真菌與土壤生態(tài)環(huán)境具有復(fù)雜的相互作用，其群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性因不同管理措施、地理環(huán)境、植被類(lèi)型、土壤肥力、pH值、溫度、降水等綜合因子的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化[3]。Thormann等[4]研究發(fā)現(xiàn)，土壤真菌群落受土地利用方式和管理模式等因素的影響，且真菌降解土壤有機(jī)質(zhì)的能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)菌的降解能力；Shen等[5]研究表明，土壤電導(dǎo)率和pH值在一定程度上影響土壤的真菌群落組成。真菌與自然環(huán)境以及田間管理等人為因素存在代謝、交流、轉(zhuǎn)化等相互作用[6]。Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)相對(duì)于微生物稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法、Biolog，PLFA分析法等，具有局限性小、準(zhǔn)確率高、靈敏度好及單次分析樣品量大等優(yōu)點(diǎn)[7]，是近年來(lái)分析土壤真菌和細(xì)菌等微生物群落結(jié)構(gòu)組成和相對(duì)豐度的重要工具。

目前，對(duì)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究引起了越來(lái)越多專(zhuān)家學(xué)者的關(guān)注，楊澤良[8]對(duì)玉米地根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)玉米真菌與土壤養(yǎng)分沒(méi)有顯著相關(guān)性，與pH值呈負(fù)相關(guān)。程躍揚(yáng)[9]研究土地利用方式對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)堿解氮是影響真菌結(jié)構(gòu)與功能類(lèi)群的主要因素。在土壤微生物中，真菌在有機(jī)質(zhì)分解、土壤肥力演變、土壤結(jié)構(gòu)形成等方面發(fā)揮重要作用，其群落結(jié)構(gòu)及多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)健康密切相關(guān)[10]。目前大多數(shù)研究主要針對(duì)小范圍的相同氣候條件下土壤微生物的影響因子分析，但對(duì)于空間區(qū)域性條件下不同氣候因子和土壤養(yǎng)分對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性及相關(guān)性的影響鮮為報(bào)道。為此，本研究依據(jù)吉林省地形地貌、氣候條件及玉米種植區(qū)特點(diǎn)，將吉林省劃分為東部濕潤(rùn)山區(qū)、中部半濕潤(rùn)平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)3個(gè)種植區(qū)[11-12]，以吉林省玉米種植區(qū)土壤為研究對(duì)象，分析種植區(qū)土壤理化性質(zhì)及酶活性特征，探討環(huán)境因子及土壤養(yǎng)分對(duì)吉林省土壤微生物真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，尋找影響吉林省玉米種植區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)因子，為吉林省土壤質(zhì)量恢復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

吉林省土地面積約1.87×107hm2，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，年平均降水量為400～600 mm，日照時(shí)數(shù)為2 259～3 016 h。本研究將吉林省玉米種植帶分為東部濕潤(rùn)山區(qū)、中部半濕潤(rùn)平原區(qū)和西部半干旱平原區(qū)3個(gè)種植區(qū)。東部濕潤(rùn)山區(qū)的年均溫度在2.9～5.5 ℃，年降雨量均值為735.08 mm，有效積溫均值為2 569.25 ℃，無(wú)霜期均值為132 d；中部半濕潤(rùn)平原區(qū)的年均溫度在4.3～6.4 ℃，年降雨量均值為605.41 mm，有效積溫均值為2 826.41 ℃，無(wú)霜期均值為142 d；西部半干旱平原區(qū)的年均溫度在4.3～5.8 ℃，年降雨量均值為442.43 mm，有效積溫均值為2 949.76 ℃，無(wú)霜期均值為143 d。

1.2 土壤樣品采集

本研究采樣點(diǎn)主要位于東部濕潤(rùn)山區(qū)的通化市、白山市和延邊市；中部半濕潤(rùn)平原區(qū)的四平市、長(zhǎng)春市、遼源市和吉林市；西部半干旱平原區(qū)的白城市和松原市。采樣時(shí)間是2018年的6—7月，采用五點(diǎn)采樣法，采樣深度0—20 cm，共采集了3個(gè)種植區(qū)的72份土壤樣品，每份樣品3次重復(fù)，以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確度。采集后的土壤樣品一部分過(guò)篩2 mm，風(fēng)干保存，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)和酶活性；另一部分置于-80 ℃冰箱進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

(1) 土壤理化性質(zhì)測(cè)定指標(biāo)：測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)化分析》[13]，pH值—電位法(水土比2.5∶1)、有機(jī)質(zhì)—重鉻酸鉀(外加熱法)、堿解氮—堿解擴(kuò)散法、速效磷—鉬銻抗比色法(碳酸氫鈉浸提)、速效鉀—火焰光度法(乙酸銨浸提)。

(2) 土壤酶活性測(cè)定指標(biāo)：脲酶活性—苯酚鈉—次氯酸鈉比色法[14]、蔗糖酶活性-3,5-二硝基水楊酸比色法[15]、磷酸酶活性—磷酸苯二鈉比色法[15]。

(3) 土壤真菌高通量測(cè)序分析：保存于-80 ℃冰箱中的土壤樣品首先參照Fast DNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))說(shuō)明提取土壤總DNA，然后采用真菌特異引物(ITS1/ITS2)對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，真菌ITS片段采用正向引物ITS1(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和反向引物ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴(kuò)增，采用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Canoco4.5軟件進(jìn)行CCA分析，采用Excel制表并作圖分析真菌門(mén)、綱、屬相對(duì)豐度，利用SPSS 19.0做單因素方差及差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

通過(guò)吉林省不同玉米種植區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)(圖1)分析可知，不同種植區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)差異性顯著。吉林省玉米種植區(qū)土壤pH均值為6.58，且呈現(xiàn)自東向西逐漸增加的趨勢(shì)；有機(jī)質(zhì)均值為13.11 g/kg，堿解氮均值為111.93 mg/kg，速效磷均值為35.42 mg/kg，速效鉀均值為128.08 mg/kg，其含量均呈現(xiàn)自東向西逐漸降低的趨勢(shì)。各種植區(qū)主要土壤類(lèi)型有所不同，東部濕潤(rùn)山區(qū)的有機(jī)質(zhì)及速效養(yǎng)分含量較高，土壤類(lèi)型以暗棕壤和白漿土為主；中部半濕潤(rùn)平原區(qū)有機(jī)質(zhì)含量相對(duì)較高，以黑土為主；西部半干旱平原區(qū)肥力相對(duì)較低，以黑鈣土為主。

注：不同小寫(xiě)字母表示在5%水平上差異顯著。下同。

2.2 土壤酶活性

從圖2可知，吉林省玉米種植區(qū)土壤的脲酶活性為36.6 mg/(g·d)，東部濕潤(rùn)山區(qū)和西部半干旱平原區(qū)的脲酶活性顯著高于中部半濕潤(rùn)平原區(qū)；蔗糖酶活性均值為120.7 mg/(g·d)，呈現(xiàn)自東向西逐漸減少的趨勢(shì)。磷酸酶活性與土壤pH值有一定相關(guān)，東部濕潤(rùn)山區(qū)的pH值偏酸性，酸性磷酸酶含量最高；西部半干旱平原區(qū)pH值偏堿性，堿性磷酸酶活性顯著高于其他兩種植區(qū)。

圖2 吉林省不同玉米種植區(qū)土壤酶活性

2.3 土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)

由表1可知，通過(guò)Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可知，東部濕潤(rùn)山區(qū)的土壤真菌豐富度顯著小于西部半干旱平原區(qū)和中部半濕潤(rùn)平原區(qū)。根據(jù)吉林省各種植區(qū)的Chao1和ACE變異系數(shù)可看出，西部半干旱平原區(qū)的變異系數(shù)最小，說(shuō)明西部半干旱平原區(qū)的樣本相對(duì)中部和東部種植區(qū)來(lái)說(shuō)更為均勻。Shannon和Simpson指數(shù)的側(cè)重點(diǎn)有所差異，前者側(cè)重于物種豐富度，后者則側(cè)重于物種均勻度；3個(gè)玉米種植區(qū)土壤真菌群落Simpson指數(shù)的平均數(shù)都為0.95，變異系數(shù)均小于5%；Shannon指數(shù)平均數(shù)在5.94～6.16之間且變異系數(shù)均較低，說(shuō)明吉林省3個(gè)種植區(qū)的真菌多樣性差異不顯著。

2.4 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門(mén)水平分類(lèi)上(圖3)，土壤真菌豐度較高的前9個(gè)門(mén)種類(lèi)分別為子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、結(jié)核菌門(mén)(Zygomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、隱真菌門(mén)(Rozellomycota)、蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)、纖毛門(mén)(Ciliophora)、球囊菌門(mén)(Glomeromycota)、新麗鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota)。從真菌門(mén)水平相對(duì)豐度圖中可知，子囊菌門(mén)(69.34%～77.98%)和擔(dān)子菌門(mén)(14.83%～23.88%)為吉林省3個(gè)玉米種植區(qū)土壤真菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，西部半干旱平原區(qū)的子囊菌門(mén)顯著高于中部半濕潤(rùn)平原區(qū)，而擔(dān)子菌門(mén)與之相反；3個(gè)種植區(qū)的結(jié)核菌門(mén)也存在顯著差異，呈自東向西逐漸降低的趨勢(shì)。

表1 吉林省不同玉米種植區(qū)土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)

圖3 真菌門(mén)水平相對(duì)豐度

綱水平分類(lèi)上選取豐度排名前20的物種，其中糞殼菌綱(Sordariomycetes)的相對(duì)豐度最高，為主要優(yōu)勢(shì)菌綱；其次為銀耳綱(Tremellomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)，其豐度均大于5%。糞殼菌綱和座囊菌綱呈現(xiàn)自東向西逐漸增加的趨勢(shì)，散囊菌綱呈現(xiàn)自東向西逐漸降低的趨勢(shì)，而銀耳綱和傘菌綱表現(xiàn)為中部半濕潤(rùn)平原區(qū)最高。

屬水平上真菌豐度較高的有酵母菌屬(Guehomyces，3.06%～8.83%)、青霉菌屬(Penicillium，1.50%～5.40%)和被孢霉屬(Mortierella，1.82%～5.66%)，其中酵母菌屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。中部半濕潤(rùn)平原區(qū)相對(duì)豐度較高的菌屬有酵母菌屬、青霉菌屬、腐殖霉屬、被孢霉屬和香筆屬，其屬所占比例均大于2%。東部半濕潤(rùn)山區(qū)相對(duì)豐度較高的菌屬有酵母菌屬、腐殖霉屬、被孢霉屬、假裸囊菌屬、曲霉屬、木霉屬和粗糙孔菌屬。而西部半干旱平原區(qū)相對(duì)豐度較高的菌屬為酵母菌屬、青霉菌屬、金擔(dān)子菌屬、莖點(diǎn)霉屬和支頂孢屬。3個(gè)種植區(qū)排名前20的菌屬一致，說(shuō)明3個(gè)種植區(qū)的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，但不同種植區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌屬含量有細(xì)微差異。由圖4可知，吉林省3個(gè)種植區(qū)中，中部半濕潤(rùn)平原區(qū)的酵母菌屬和腐殖霉屬含量最高，青霉菌屬、莖點(diǎn)霉屬和金擔(dān)子菌屬呈現(xiàn)自東向西逐漸增加的趨勢(shì)，被孢霉屬、曲霉屬真菌、假裸囊菌屬和木霉屬呈現(xiàn)自東向西逐漸減少的趨勢(shì)。

圖4 真菌屬水平相對(duì)豐度

2.5 環(huán)境因子對(duì)土壤真菌群落組成的影響

為進(jìn)一步研究吉林省不同玉米種植區(qū)土壤真菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系，采用典范對(duì)應(yīng)分析方法，對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)、酶活性、氣候因子(積溫、無(wú)霜期、年均降雨量和年均溫度等)與土壤真菌群落的關(guān)系進(jìn)行研究，尋找影響土壤真菌群落組成的驅(qū)動(dòng)因子。通過(guò)圖5可知，氣候因子中積溫、無(wú)霜期和年均溫度對(duì)土壤真菌微生物群落結(jié)構(gòu)影響程度最高，土壤化學(xué)性質(zhì)中pH值對(duì)土壤的影響程度最高。年均降雨量(rainfall)、酸性磷酸酶(ACP)、中性磷酸酶(NP)、堿解氮(AN)、速效磷(AP)、速效鉀(AK)、脲酶活性(urease activity)和有機(jī)質(zhì)(OM)之間夾角為銳角，pH值、積溫(accumulated Tep)、年均溫度(Tep)、堿性磷酸酶(ALP)之間，pH值與蔗糖酶(sucrase activity)之間均為銳角，表明這幾種環(huán)境因子之間呈正相關(guān)關(guān)系，可能具有一定的協(xié)同效應(yīng)。從吉林省玉米不同種植區(qū)的真菌群落分布看，西部半干旱平原區(qū)的土壤樣品大部分分布在橫坐標(biāo)軸的負(fù)方向，東部濕潤(rùn)山區(qū)的土壤樣品真菌分布主要在CCA橫坐標(biāo)軸的正方向，而中部半濕潤(rùn)平原區(qū)的土壤樣品真菌分布主要集中在坐標(biāo)軸附近。西部、東部和中部種植區(qū)樣本真菌分布有很大部分重合，說(shuō)明3個(gè)地區(qū)有很大的相似性；但東部和西部相對(duì)距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明兩個(gè)種植區(qū)中的土壤微生物真菌群落結(jié)構(gòu)又有各自相對(duì)獨(dú)特的特點(diǎn)。

注：Accum Tep代表積溫； FFP代表無(wú)霜期； Tep代表年均溫度； Rainfall代表年均降雨量； ALP代表堿性磷酸酶活性； Sucrase Activity代表蔗糖酶活性； Urease Activity代表脲酶活性； NP代表中性磷酸酶活性； OM代表有機(jī)質(zhì)含量； AN代表堿解氮含量； AK代表速效鉀含量； AP代表速效磷含量。

3 討 論

3.1 積溫、無(wú)霜期和年均溫度對(duì)土壤真菌微生物的影響

土壤微生物對(duì)不同環(huán)境因子的的響應(yīng)存在差異性，真菌作為微生物區(qū)系的主要組成部分，是土壤生態(tài)系統(tǒng)健康與否的重要指標(biāo)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)積溫、無(wú)霜期和年均溫度是影響該區(qū)域土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的重要?dú)夂蛞蜃印?個(gè)種植區(qū)真菌群落有很大的相似性主要是由于他們有相似的區(qū)域氣候特征，而差異性的存在可能主要是由于3個(gè)生態(tài)區(qū)不同的地形地貌的形成了各自小氣候特征。東部地區(qū)隸屬長(zhǎng)白山脈海拔高，年均溫度較低，無(wú)霜期較短；而中部地區(qū)屬于世界黃金玉米帶，氣候條件非常有利于玉米生長(zhǎng)，產(chǎn)量也是全省最高的地區(qū)；西部地區(qū)積溫較高，年均溫度與中部地區(qū)相似，但由于相對(duì)干旱且土壤大多為鹽堿地而使得土壤微生物結(jié)構(gòu)與中部也略有不同。有研究證明，溫度對(duì)光合作用影響最大，溫度升高影響了凋落物的數(shù)量和質(zhì)量，增加了碳的有效性，增高C/N比值[17]，明顯提高土壤真菌的活性和豐富度[18]，從而改變了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。近年來(lái)，也有少數(shù)研究證明了積溫[19]、年均溫度[20]、無(wú)霜期[21]對(duì)作物產(chǎn)量的影響程度，與本研究結(jié)果相符。還有研究發(fā)現(xiàn)，土壤真菌對(duì)土壤溫度、濕度、養(yǎng)分含量等因素的變化十分敏感[22]，真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性也會(huì)受到季節(jié)變化的影響[23]。土壤真菌多樣性與土壤生態(tài)環(huán)境密不可分，且土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主要受地理因素、土壤養(yǎng)分、管理模式以及氣候條件等多種因素的影響，不同種植區(qū)的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致土壤真菌種類(lèi)和數(shù)量的差異性[24]，這一結(jié)論與Davide等[25]研究結(jié)果一致。

3.2 pH值對(duì)土壤真菌的影響

土壤和植物間的相互作用可以直接或間接地影響土壤真菌群落組成和多樣性，土壤的化學(xué)性質(zhì)與真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性有著密切的聯(lián)系。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值是影響土壤真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)因素。這與韓世忠等[26]人的研究結(jié)果一致。同樣，王楠楠等[27]人的研究均證明了土壤pH值對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與組成影響顯著。巨天珍等[28]研究認(rèn)為，真菌更喜歡在偏酸性的土壤中生存。地理因素和人為因素都會(huì)在一定程度上導(dǎo)致土壤質(zhì)量發(fā)生變化，例如，施肥可以改變土壤的特性，長(zhǎng)期施用氮肥造成土壤pH值下降，有機(jī)質(zhì)含量下降，土壤中真菌群落密度增加[29]，長(zhǎng)期施用有機(jī)肥也會(huì)引起土壤微生物組成差異，提高土壤中微生物群落多樣性[30]，顯著降低土壤真菌與細(xì)菌的比率，從而改變真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[31]。也有相關(guān)研究認(rèn)為[32]，土壤堿解氮含量也是導(dǎo)致土壤真菌群落變化的重要因素。真菌群落結(jié)構(gòu)必然會(huì)受到土壤環(huán)境因子的直接或間接的影響，但就本研究而言，土壤pH是導(dǎo)致吉林省不同種植區(qū)玉米主產(chǎn)區(qū)真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的重要化學(xué)驅(qū)動(dòng)因素。

4 結(jié) 論

積溫、無(wú)霜期和年均溫度是影響吉林省玉米種植區(qū)土壤真菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群變化的主要?dú)夂蝌?qū)動(dòng)因子；pH值是主要化學(xué)驅(qū)動(dòng)因子。隨著全球氣候變暖，氣候變化將不可避免，同時(shí)由于施肥影響，土壤多呈酸化趨勢(shì)，隨之必將帶來(lái)土壤微生物環(huán)境的變化，進(jìn)而影響土壤質(zhì)量和作物生產(chǎn)。因此應(yīng)多關(guān)注吉林省玉米種植區(qū)土壤真菌群落變化趨勢(shì)，以便采取合理的管理措施以改善并恢復(fù)土壤質(zhì)量。