李 陽(yáng)，張麗珍，楊 埔，張一中

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中 030600）

食醋在春秋時(shí)期就有記載，是一種常見(jiàn)的酸味調(diào)味料，通常以糧食為主料，加入大曲后進(jìn)行糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵[1]，再加水淋制最終得到成品醋的過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程中微生物種類眾多、成分豐富，含有多種維生素、氨基酸[2]，還有黃酮、酚酸[3]等有益成分，在降低血壓[4]、緩解疲勞[5]等方面有顯著效果，因此人們對(duì)食醋的需求也越來(lái)越高。傳統(tǒng)食醋的釀造原料需要經(jīng)過(guò)蒸煮，生料醋的特色就是原料與發(fā)酵劑混合后直接發(fā)酵[6]，釀造過(guò)程中反應(yīng)類型更多、更復(fù)雜[7]，因此口感與傳統(tǒng)食醋相比更加醇厚。

醋酸菌在釀造過(guò)程中扮演重要角色，負(fù)責(zé)將乙醇氧化成乙酸[8-9]，過(guò)高的乙醇含量會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)[10]，不適的溫度會(huì)破壞發(fā)酵酶類的活性[11]，因此探究合適的初始乙醇含量和發(fā)酵溫度尤為重要。關(guān)于生料醋醅中醋酸菌的研究相對(duì)較少，可以參考的數(shù)據(jù)不多。陳洋[12]從浙江等醋廠中篩選出了耐10%乙醇、耐40℃高溫的醋酸桿菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為巴氏醋桿菌，并研究了其耐乙醇機(jī)制。胡宇豪等人[13]對(duì)耐12%乙醇的巴氏醋桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得出在常規(guī)培養(yǎng)基中加入5.5%乙醇、0.5%乙酸時(shí)，產(chǎn)酸量可以最大程度地提高。李文等人[14]從腐爛的獼猴桃中篩選出一株醋酸菌，耐40℃高溫、耐12%高醇，經(jīng)研究可使產(chǎn)酸量提高30.54%。向進(jìn)樂(lè)等人[15]從木瓜醋中檢測(cè)出了草酸、酒石酸等10種有機(jī)酸，且醋酸含量最高。目前，生料醋的研究尚存在較多空白，比如有機(jī)酸的類型、高溫、高醇對(duì)其發(fā)酵性能的影響等。

試驗(yàn)以自然發(fā)酵的生料醋醅為樣品，分離純化出醋酸菌菌種，再通過(guò)菌落形態(tài)特征、產(chǎn)酸定性試驗(yàn)、16S rDNA序列的分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。發(fā)酵過(guò)程中添加不同含量的乙醇，研究不同溫度下對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸特性的影響，研究成果可以作為優(yōu)化醋酸發(fā)酵的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨4 g/L，瓊脂12 g/L，1.6%溴甲酚紫4 000 μL，滅菌后加入3%無(wú)水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，瓊脂12 g/L，接種前加入5%無(wú)水乙醇。

1.1.2 試劑

無(wú)水葡萄糖，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司提供；硫酸鎂，天津市北辰方正試劑廠提供；磷酸二氫鉀，北京精求化工廠提供；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；無(wú)水乙醇，天津歐博凱化工有限公司提供；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司提供；甲醇（色譜純）、甘油，北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，安捷倫科技公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰AIRTECH產(chǎn)品；AD-88型大容量全溫氣浴振蕩器，常州國(guó)宇儀器制造有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；MS7-H550-Pro型磁力攪拌器，SCILOGEX產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌的篩選

從發(fā)酵了12，18，24，30，36 d的醋醅中采樣約10 g，再分別加入裝有50 mL蒸餾水的錐形瓶中，于28℃條件下，以轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，將樣品稀釋至10-3，吸取50 μL涂布至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，菌落長(zhǎng)出后，多次分離純化，直至長(zhǎng)出單一菌落，最后挑取菌落加入到甘油培養(yǎng)基中，于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)

挑取菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基活化2次，接入到加有溴甲酚紫酸堿指示劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于28℃條件下培養(yǎng)2～3 d，可使培養(yǎng)基變成黃色的菌株為產(chǎn)酸細(xì)菌。

1.3.3 菌種鑒定

篩選出菌種后編號(hào)為1，觀察其形態(tài)特征并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定其分類地位。

1.3.4 醋酸菌的產(chǎn)酸特性試驗(yàn)

醋酸菌涂布發(fā)酵培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱活化2～3 d，挑取已活化的菌株接種到試管發(fā)酵培養(yǎng)液，于振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，吸取2%的發(fā)酵培養(yǎng)液至錐形瓶培養(yǎng)48 h，從0 h開(kāi)始，每隔12 h采一次樣。乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置6個(gè)梯度，分別是0，2%，4%，6%，8%，10%；培養(yǎng)溫度分別為37，42，47℃，通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定產(chǎn)酸類型和產(chǎn)酸量。

1.3.5 高效液相色譜條件

產(chǎn)酸高效液相色譜檢測(cè)條件參照楊鈺昆等人[16]的測(cè)定方法。色譜柱為AQ-C18；流動(dòng)相為甲醇∶磷酸二氫鉀 （0.02 mol/L） 為 3∶97（V/V），磷酸調(diào) pH值至2.7，流速1.00 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

將通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)利用SPSS 20軟件分析和Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的鑒定

2.1.1 醋酸菌的分離

菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。

該菌長(zhǎng)勢(shì)良好，菌落為白色小圓形，表面光滑，邊緣整齊。

2.1.2 醋酸菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定。挑取醋酸菌滴至有無(wú)菌水的載玻片上，干燥后用草酸銨結(jié)晶紫染液染色60 s，純凈水沖去多余染液，干燥后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。菌體呈短棒狀，單個(gè)或多個(gè)排列。

顯微鏡觀察圖見(jiàn)圖2。

（2）分子生物學(xué)鑒定。

醋酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

2.2 37℃條件下發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化

2.2.1 乳酸含量變化

乳酸含量變化見(jiàn)圖4。

圖2 顯微鏡觀察圖

圖3 醋酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 乳酸含量變化

由圖4可知，不同乙醇含量的發(fā)酵液中，乳酸均呈增加趨勢(shì)。乳酸含量受乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較大，發(fā)酵48 h后，乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%和10%的培養(yǎng)液中乳酸含量最低，為2.6 mg/mL；添加量為2%時(shí)，乳酸含量達(dá)到最大，為4.7 mg/mL。

2.2.2 乙酸含量變化

乙酸含量變化見(jiàn)圖5。

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)乙酸含量由0增加到1.8 mg/100 mL；添加8%和10%乙醇時(shí)，發(fā)酵0 h檢測(cè)到乙酸含量為0.34 mg/100 mL和-0.36 mg/100 mL，可能是種子培養(yǎng)基代入，12 h后下降到0；添加0，4%，6%乙醇在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到乙酸。

2.2.3 檸檬酸含量的變化

檸檬酸含量變化見(jiàn)圖6。

由圖6可知，乙醇含量為4%時(shí)檸檬酸含量最高，發(fā)酵24 h含量最大，為0.08 mg/mL，高于添加量為8%的檸檬酸含量。不同的乙醇添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量的影響各不相同，其中添加量為10%時(shí)檸檬酸含量最低，可見(jiàn)高濃度乙醇含量不利于醋酸菌的發(fā)酵。

圖5 乙酸含量變化

圖6 檸檬酸含量變化

2.3 42℃條件下發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化

2.3.1 乳酸含量變化

乳酸含量變化見(jiàn)圖7。

圖7 乳酸含量變化

由圖7可知，乙醇添加量越少，發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量增加越多，發(fā)酵48 h添加6%乙醇的培養(yǎng)液中，乳酸含量最高達(dá)到3.9 mg/mL；添加量為10%的乙醇在發(fā)酵至48 h時(shí)，乳酸含量最低，為3.1 mg/mL。

2.3.2 乙酸含量變化

乙酸含量變化見(jiàn)圖8。

由圖8可知，乙醇添加量為8%時(shí)，在48 h檢測(cè)到乙酸含量為3.4 mg/100 mL，高于37℃乙酸的最高含量；添加10%乙醇，發(fā)酵液中乙酸含量維持在2.5～3.4 mg/100 mL，高于添加6%乙醇檢測(cè)到的乙酸含量；添加0，2%，4%乙醇在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到乙酸。

2.3.3 檸檬酸含量變化

檸檬酸含量變化見(jiàn)圖9。

圖8 乙酸含量變化

圖9 檸檬酸含量變化

由圖9可知，乙醇添加量越少，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量的影響越低，發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸均呈增加的趨勢(shì)，添加量為4%的發(fā)酵液中檸檬酸含量最多，48 h達(dá)到0.17 mg/mL。

2.4 47℃條件下發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化

2.4.1 草酸含量變化

草酸含量變化見(jiàn)圖10。

圖10 草酸含量變化

由圖10可知，不添加乙醇的培養(yǎng)液中草酸含量最高，48 h含量達(dá)到2.5 mg/100 mL，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，添加2%乙醇的培養(yǎng)液中生成的草酸為1.7 mg/100 mL，均高于其他乙醇添加量；添加10%時(shí)草酸含量增加最低，發(fā)酵至48 h只有1.03 mg/100 mL。

2.4.2 乙酸含量變化

乙酸含量變化見(jiàn)圖11。

圖11 乙酸含量變化

由圖11可知，除0外，不同乙醇添加量的發(fā)酵液中，乙酸含量都呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中添加2%的乙醇時(shí)乙酸含量最高，發(fā)酵48 h可達(dá)1.97 mg/100 mL；不添加乙醇的培養(yǎng)液中乙酸含量為0，可見(jiàn)乙醇可促進(jìn)乙酸的生成。

2.4.3 乳酸含量變化

乳酸含量變化見(jiàn)圖12。

圖12 乳酸含量變化

由圖12可知，乳酸含量在發(fā)酵24 h內(nèi)都有不同程度的下降，24～48 h繼續(xù)增長(zhǎng)，可能是由于發(fā)酵初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗太快，乳酸作為碳源被利用。觀察不同乙醇含量對(duì)乳酸的影響，得出添加2%的乙醇，乳酸含量最高，發(fā)酵48 h達(dá)到5.02 mg/mL；添加4%乙醇乳酸含量最低，在48 h檢測(cè)只有3.19 mg/mL，低于42℃培養(yǎng)條件下檢測(cè)到的乳酸含量，可見(jiàn)溫度也是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從生料醋醅中篩選出醋酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA鑒定為巴氏醋桿菌，通過(guò)改變其發(fā)酵過(guò)程中的溫度和乙醇添加量，研究其對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸特性的影響。

溫度設(shè)置37，42，47℃3個(gè)梯度，乙醇添加量設(shè)置0，2%，4%，6%，8%，10%6個(gè)梯度。將2%的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵液后通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)樣品，檢測(cè)到的有機(jī)酸有草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，比趙方圓等人[17]的試驗(yàn)結(jié)果多一類草酸。不同溫度、乙醇含量對(duì)有機(jī)酸的生成影響較大，乙醇添加量為10%時(shí)有機(jī)酸的生成都受到了抑制，可見(jiàn)高濃度的乙醇會(huì)影響微生物的活性，與張?jiān)玛?yáng)等人[18]的研究結(jié)果一致。37，42，47℃3個(gè)溫度下最適宜有機(jī)酸生成的乙醇添加量分別是4%，6%，2%，耐受性低于孫文瑛等人[19]從腐爛水果中篩出的耐11%乙醇的醋酸菌。分析不同溫度下幾種有機(jī)酸的產(chǎn)酸量，可知42℃更適宜巴氏醋桿菌產(chǎn)酸，此菌株對(duì)溫度的耐受性高于邵建寧等人[20]研究的耐40℃高溫的醋酸菌。檢測(cè)到的有機(jī)酸中，乳酸含量最高為5.0 mg/mL，在42℃，8%乙醇條件下乙酸含量最高為4.2 mg/100 mL，二者在醋中均是含量最高的有機(jī)酸，與方冠宇等人[21]的研究結(jié)果一致。草酸、檸檬酸的含量最高時(shí)分別是2.5 mg/100 mL，0.17mg/mL，這類不揮發(fā)有機(jī)酸的存在很好地中和了乙酸帶來(lái)的刺激感，使醋的酸味更加柔和爽口。

通過(guò)對(duì)生料醋醅中的巴氏醋桿菌進(jìn)行研究，挑選出發(fā)酵的最適溫度和最適乙醇含量，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，最大程度增加生料醋中有機(jī)酸的含量，提升生料醋的口感，也為生料醋產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供參考。