劉凱凱，唐君瑋，袁廷柱，宋靜靜，劉洪軍，蓋珊珊，遲雯丹，于道德**

(1.山東省海洋生物研究院，山東青島 266104；2.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266104；3.青島市淺海底棲漁業(yè)增殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266104；4.長(zhǎng)島海洋生態(tài)文明綜合試驗(yàn)區(qū)海洋經(jīng)濟(jì)促進(jìn)中心，山東煙臺(tái) 265800)

0 引言

溶氧(Dissolved Oxygen,DO)作為水域環(huán)境的一個(gè)重要參數(shù)，與所有水域生物的生存密切相關(guān)。水體中的溶氧含量是影響水生生物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。溶氧含量過(guò)低時(shí)，底層魚類和其他活動(dòng)性較強(qiáng)的無(wú)脊椎動(dòng)物可以通過(guò)遷徙來(lái)逃避低氧環(huán)境，而活動(dòng)性能力差的貝類更容易受到缺氧脅迫的影響；在溶氧回升后，某些受損害群落(如牡蠣礁)難以恢復(fù)到以前的狀態(tài)[1-2]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，潮間帶的貝類形成了相應(yīng)的應(yīng)激機(jī)制，已成為最耐低氧的生物類群之一。

在過(guò)去的幾十年內(nèi)，由于人類活動(dòng)的影響，水域的溶氧(尤其是海洋)已發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了大量的低氧區(qū)域(Oxygen Minimum Zones,OMZs)[3-4]。低氧(Hypoxia)泛指水體溶氧含量低于2.0 mL/L (相當(dāng)于2.8 mg/L或者91.4 mmol/L)，并可細(xì)分為3個(gè)等級(jí)：(1)≤2.0 mL/L DO，氧氣不足，生物體開始表現(xiàn)出異常行為；(2)≤1.0 mL/L DO，輕度缺氧，生物開始出現(xiàn)死亡；(3)≤0.5 mL/L DO，嚴(yán)重缺氧，生物大量死亡。而缺氧(Anoxia)則是指氧分壓小于0.07 mL/L DO的水域，或者嚴(yán)格的無(wú)氧狀態(tài)(0 mL/L DO)[5-6]。

利用缺氧來(lái)檢測(cè)環(huán)境脅迫對(duì)貝類的負(fù)面影響具有很多優(yōu)勢(shì)，包括操作簡(jiǎn)易、重復(fù)性高以及成本低等[7-8]。海洋貝類作為濾食動(dòng)物，對(duì)環(huán)境保護(hù)的貢獻(xiàn)不容忽視。因此，研究貝類的缺氧脅迫不僅對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義，同時(shí)對(duì)于整個(gè)海洋生態(tài)的維持和可持續(xù)發(fā)展更具有深遠(yuǎn)的影響。

1 海洋缺氧的原因與發(fā)展趨勢(shì)

由自然界物理作用引起的水體溫度和鹽度的分層，以及溫鹽躍層的出現(xiàn)是導(dǎo)致近岸海底缺氧的主要原因，缺氧通?？梢鸬讞珓?dòng)物死亡。如果水體能夠自然交換，或者說(shuō)沒(méi)有分層現(xiàn)象，自然界就根本不會(huì)存在缺氧的區(qū)域[9]。近年來(lái)的研究表明，分層現(xiàn)象導(dǎo)致全球海洋上層和溫躍層氧氣含量減少[10-11]。這種自然發(fā)生的缺氧現(xiàn)象最早記錄于19世紀(jì)80年代，并且呈現(xiàn)出一定的周期性[12]。例如，發(fā)生在美國(guó)亞拉巴馬州莫比爾灣的“Jubilee”現(xiàn)象可以追溯到18世紀(jì)60年代?！癑ubilee”現(xiàn)象就是一個(gè)典型的季節(jié)性缺氧，幾乎每年夏季發(fā)生一次，主要是由有機(jī)物的沉積造成的[13]。

人類活動(dòng)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，是造成水體缺氧的另一個(gè)重要原因。近岸水域由于陸源輸入大量的N、P和Si等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和大量可供微生物分解利用的有機(jī)物(包括城市生活污水、工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)化肥過(guò)量使用等)[14]，造成了水體富營(yíng)養(yǎng)化，使缺氧現(xiàn)象發(fā)生在從未發(fā)生過(guò)的區(qū)域，這樣的區(qū)域被生態(tài)學(xué)家稱為“死亡區(qū)域”(Dead Zone)。目前，世界范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)500多個(gè)死亡區(qū)域，共涉及245 000 km2的海域[15]。而且在每年的夏季(水溫最高時(shí)，分層最強(qiáng))超過(guò)一半的區(qū)域都會(huì)發(fā)生缺氧現(xiàn)象，導(dǎo)致海洋底棲生物大量死亡[5-6]。水體缺氧已經(jīng)成為全球生態(tài)與環(huán)境問(wèn)題的主要關(guān)注點(diǎn)之一。我國(guó)近海水體缺氧現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重，在長(zhǎng)江口、珠江口等區(qū)域已出現(xiàn)了季節(jié)性的缺氧[16-17]。

2 貝類對(duì)缺氧脅迫的適應(yīng)性進(jìn)化

生活于潮間帶的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物每天都會(huì)經(jīng)歷一段低氧時(shí)期，降低代謝率是其對(duì)低氧脅迫的首要適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲牡蠣(Crassostreavirginica)在低氧期的基礎(chǔ)代謝率僅為正常狀態(tài)的75%[20]，其主要通過(guò)可逆的蛋白磷酸化修飾來(lái)限制大多數(shù)酶和功能蛋白的活性，從而降低基礎(chǔ)代謝率[21]；當(dāng)環(huán)境條件改善后，則可恢復(fù)相關(guān)酶類和功能蛋白的活性，從而維持機(jī)體的正常生理活動(dòng)。其次，貝類適應(yīng)缺氧環(huán)境的另一個(gè)機(jī)制是通過(guò)消耗貯存的能源物質(zhì)(如糖原和天冬氨酸鹽類等)，改變其代謝途徑(如糖酵解)，并聯(lián)合底物水平的磷酸化而產(chǎn)生更多的能量供給機(jī)體[19]。例如翡翠股貽貝(Pernaviridis)就是通過(guò)肝糖原的糖酵解，產(chǎn)生更多的ATP來(lái)維持基礎(chǔ)代謝[22-23]。再次，就是改變糖酵解的終產(chǎn)物，避免乳酸過(guò)多而破壞機(jī)體的酸堿平衡。歐洲鳥尾蛤(Cerastodermaedule)會(huì)產(chǎn)生L-丙氨酸和D-乳酸鹽兩種糖酵解物質(zhì)，大大降低了代謝產(chǎn)物的酸性[24]，其中L-丙氨酸主要是通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生，與天冬氨酸向琥珀酸的轉(zhuǎn)變相偶聯(lián)[19]。當(dāng)環(huán)境達(dá)到缺氧狀態(tài)，貝類會(huì)進(jìn)一步降低基礎(chǔ)代謝率和ATP的產(chǎn)生及利用，甚至可以降低到基礎(chǔ)水平的10%[25]。許多耗能過(guò)程都會(huì)受到不同程度的抑制，包括大分子物質(zhì)，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等[19]。

3 缺氧對(duì)貝類免疫系統(tǒng)的影響

缺氧脅迫能夠影響貝類很多重要的生理和生化過(guò)程[19,26]。其中對(duì)免疫系統(tǒng)的影響最大，因此通過(guò)免疫指標(biāo)的變化來(lái)檢測(cè)環(huán)境壓力對(duì)貝類的影響已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[27]。貝類作為無(wú)脊椎動(dòng)物，體內(nèi)沒(méi)有特異性免疫細(xì)胞和相應(yīng)的抗體。貝類的免疫防御機(jī)制可分為細(xì)胞免疫與體液免疫，兩者相輔相成，共同抵御外來(lái)物質(zhì)的入侵，并對(duì)應(yīng)激做出免疫應(yīng)答。

3.1 缺氧對(duì)細(xì)胞免疫的影響

雙殼貝類的血淋巴細(xì)胞具有多種功能，包括免疫防御、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄以及貝殼的修復(fù)、礦化等[28]。異物侵入機(jī)體能夠刺激血淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用[29]。在血淋巴細(xì)胞吞噬過(guò)程中，同時(shí)會(huì)釋放一些水解酶和溶菌酶，這樣能夠幫助滅活其他部位的入侵病原菌[30]。因此，血淋巴細(xì)胞的任何參數(shù)，包括比容、數(shù)量、分布、吸附能力、吞噬活性、相關(guān)溶酶體酶活性以及血淋巴產(chǎn)生的活性氧等都成為檢測(cè)環(huán)境脅迫對(duì)免疫系統(tǒng)影響程度的重要指標(biāo)[27,31]。

缺氧脅迫幾乎能夠影響到與血淋巴細(xì)胞相關(guān)的所有的功能，整合作用導(dǎo)致雙殼貝類血淋巴細(xì)胞的免疫活性大大降低[32]，進(jìn)而是雙殼貝類的免疫功能受到抑制，對(duì)病原體的易感性也隨之增加，是貝類死亡的主要原因[33]。

3.1.1 缺氧對(duì)血細(xì)胞總數(shù)的影響

貝類的免疫防御反應(yīng)中，血淋巴細(xì)胞對(duì)病原菌和異物的吞噬作用是其主要的防御機(jī)制。血細(xì)胞總數(shù)(THC)增加不僅僅包括血淋巴細(xì)胞的增殖，還包括從組織中遷徙到血淋巴循環(huán)中的細(xì)胞數(shù)量。相反地，貝類血淋巴細(xì)胞溶解或從血淋巴移入組織，將會(huì)導(dǎo)致THC降低，從而降低其防御能力，更容易受到病原菌的攻擊[34]。實(shí)驗(yàn)表明，低氧脅迫24 h，雞簾蛤(Chameleagallina)的THC就開始急劇降低，并持續(xù)4 d左右[31]。缺氧條件下，翡翠貽貝(Pernaviridis)血淋巴中的THC顯著低于正常溶氧組[35]。THC的降低可能是貝類血淋巴細(xì)胞溶解以及大量血淋巴細(xì)胞移入組織所致，在這一點(diǎn)上與其他脅迫類似[34,36]。

3.1.2 缺氧對(duì)細(xì)胞吞噬作用的影響

貝類血淋巴細(xì)胞的吞噬作用是其抵御外來(lái)微生物的第一道防線，有時(shí)也是最重要的免疫手段[34,37-38]。實(shí)際上，除免疫功能外，血淋巴細(xì)胞的吞噬作用在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)上也發(fā)揮重要作用[39]。因此，血淋巴細(xì)胞的吞噬活性通常被作為評(píng)估貝類對(duì)環(huán)境脅迫耐受力的生物指標(biāo)[40-41]。

貝類血細(xì)胞的粘附能力是其發(fā)揮免疫功能的前提和基礎(chǔ)。細(xì)胞的粘附能力依賴于自身細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性[42]，在粘附分子與配體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控下，改變細(xì)胞形態(tài)而發(fā)生粘附[43]。由于此過(guò)程為耗能過(guò)程，依賴于細(xì)胞自身能量?jī)?chǔ)備，在低氧期細(xì)胞能量的重新分配使得用于粘附的能量大大降低，從而降低了血細(xì)胞的粘附能力。在粘附發(fā)生后，通過(guò)細(xì)胞骨架變化調(diào)控偽足形成的過(guò)程等是發(fā)生吞噬作用的基礎(chǔ)，此過(guò)程為耗能過(guò)程，需要聯(lián)合ATP的生成，但是在缺氧條件下不能獲得足夠的能量，因此吞噬活性大大降低[44]。利用血液涂片發(fā)現(xiàn)，受缺氧脅迫的雞簾蛤(Chameleagallina)的血淋巴細(xì)胞完全不能吞噬酵母細(xì)胞。缺氧導(dǎo)致血細(xì)胞吞噬活性的降低，除了與耗能關(guān)聯(lián)外，還可能與血淋巴細(xì)胞膜受體的改變相關(guān)[27]。

3.1.3 缺氧對(duì)活性氧的影響

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)及其中間產(chǎn)物(Reactive Oxygen Intermediate Species，ROIs)是血淋巴細(xì)胞在吞噬過(guò)程中伴隨呼吸爆發(fā)現(xiàn)象產(chǎn)生的，是貝類免疫的重要組成部分[45]。貝類產(chǎn)生的ROS包括超氧化物陰離子、過(guò)氧化氫、羥基自由基、超鹵化物等。在受到病原菌感染時(shí)，貝類的血淋巴細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，過(guò)多的ROS會(huì)造成細(xì)胞的膜損傷，DNA斷裂，酶抑制和氨基酸過(guò)氧化等毒性效應(yīng)[46]。而在缺氧脅迫下，牡蠣血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力大大降低，僅為正常情況的1/3[32]。從生存的角度考慮，是為了降低基礎(chǔ)代謝率犧牲了抗氧化酶的活性[47]，同時(shí)也可以減少ROS對(duì)自身組織的損傷以及修復(fù)所需的大量能量。

3.2 缺氧對(duì)體液免疫的影響

在缺氧脅迫下，貝類除了細(xì)胞免疫方式外，血淋巴中的體液因子也發(fā)揮重要的防御作用。參與體液免疫的活性因子主要包括：溶酶體酶、過(guò)氧化氫酶、抗菌肽等。

3.2.1 缺氧對(duì)溶酶體酶活性的影響

缺氧同樣可影響貝類溶酶體酶的活性。溶酶體酶由血淋巴細(xì)胞合成，并在吞噬過(guò)程中通過(guò)脫顆粒的方式釋放入血淋巴循環(huán)中，參與體液免疫[48]。雙殼貝類溶酶體酶包括溶菌酶、β-葡糖苷酸酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脂肪酶、氨基肽酶、乳酸脫氫酶和淀粉酶等。其中，酸性磷酸酶和β-葡糖苷酸酶是后生動(dòng)物典型的兩種溶酶體酶，而溶菌酶則具有免疫防御功能，可對(duì)抗多種革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌[49]。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠?qū)е掠矚じ?Mercenariamercenaria)血細(xì)胞和血淋巴循環(huán)中溶菌酶、酸性磷酸酶等活性明顯降低[27,50]。但是，作為誘導(dǎo)型酶的β-葡糖苷酸酶在缺氧脅迫時(shí)活性增加，可能該酶參與了抑制缺氧狀態(tài)下厭氧細(xì)菌(硫酸還原菌等)的大量繁殖[4]。菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)在受低氧脅迫時(shí)間越長(zhǎng)的條件下，乳酸脫氫酶(LDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)的活力逐漸降低，而堿性磷酸酶(AKP)活力逐漸增大，不同的酶活在低氧條件下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律[51]。

3.2.2 缺氧對(duì)抗氧化防御系統(tǒng)的影響

抗氧化酶系統(tǒng)也是無(wú)脊椎動(dòng)物非特異性免疫的重要組成部分。過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶類與抗氧化因子(如谷胱甘肽等)共同組成了抗氧化酶系統(tǒng)，共同作用于體內(nèi)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基，用于清除體內(nèi)多余的活性氧，以維持體內(nèi)氧化還原平衡。王化敏等[52]研究結(jié)果表明，隨著低氧脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4種殼色的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的硫氧化還蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)表達(dá)量均表現(xiàn)出先升高后恢復(fù)的趨勢(shì)，而CAT和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)在2 mg·L-1的低氧環(huán)境下脅迫24 h后，肌肉組織的CAT、SOD基因表達(dá)量顯著降低[53]。這表明低氧會(huì)誘導(dǎo)貝類體內(nèi)抗氧化酶表達(dá)量發(fā)生變化，而抗氧化酶表達(dá)量的高低，能夠反映出動(dòng)物對(duì)低氧耐受能力的差異[52]。

3.3 缺氧對(duì)化學(xué)遞質(zhì)的影響

缺氧脅迫幾乎影響到貝類細(xì)胞免疫和體液免疫的所有參數(shù)，但是確切的機(jī)制尚不明了。缺氧可能導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)綜合征或全身適應(yīng)綜合征(General Adaptation Syndrome,GAS)，從而影響到血淋巴細(xì)胞的功能性反應(yīng)。貝類雖然僅具有簡(jiǎn)單的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，但是面對(duì)環(huán)境脅迫，同樣會(huì)啟動(dòng)類似脊椎動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)：即促腎上腺皮質(zhì)釋放激素(Corticotropin-releasing Hormone,CRH)—促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropin Hormone,ACTH)—生物胺(Biogenic Amines)神經(jīng)內(nèi)分泌軸，分泌以兒茶酚胺類物質(zhì)為主的應(yīng)激激素(主要是去甲腎上腺素，腎上腺素和多巴胺)[39,54-55]。研究發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素(Noradrenalin,NA)作為貝類中最重要的兒茶酚胺類，同樣是由血淋巴細(xì)胞合成并釋放入血淋巴中發(fā)揮作用[54]。NA能夠抑制雙殼貝類特定的免疫反應(yīng)，例如吞噬作用[56]和活性氧ROS的產(chǎn)生[57]。因此，缺氧狀態(tài)可能首先作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過(guò)誘導(dǎo)NA的釋放從而抑制血淋巴細(xì)胞的活性。這從側(cè)面也說(shuō)明了，在低等的無(wú)脊椎動(dòng)物中，仍然存在復(fù)雜的免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[58]。

3.4 缺氧對(duì)免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

在缺氧脅迫下，貝類部分基因的表達(dá)和蛋白的合成過(guò)程會(huì)受到抑制，例如呼吸作用、糖/脂類代謝、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過(guò)程[59]。但是，某些特定基因的表達(dá)量也會(huì)出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。在缺氧脅迫24 d后，牡蠣肝糖原磷酸化酶mRNA的表達(dá)量上調(diào)，目的就是通過(guò)以無(wú)氧糖酵解的方式降解肝糖原來(lái)維持機(jī)體對(duì)能量的需求[60-61]。其中，缺氧脅迫對(duì)活性氧產(chǎn)生相關(guān)基因以及維持機(jī)體氧化還原平衡基因表達(dá)的抑制效應(yīng)，與環(huán)境污染物(烴基化合物)[62]、感染寄生蟲[63]以及殺蟲劑[64]等環(huán)境脅迫的作用類似。

4 展望

綜上所述，缺氧脅迫對(duì)貝類免疫系統(tǒng)的影響深遠(yuǎn)，影響貝類血淋巴細(xì)胞的所有免疫參數(shù)，并降低貝類的免疫監(jiān)視作用，引起貝類免疫應(yīng)激并造成免疫損傷。除此之外，缺氧條件(尤其是在靜水條件下)還會(huì)增加貝類機(jī)會(huì)性致病菌的繁殖，進(jìn)一步降低水體的氧氣含量，例如厭氧的硫酸鹽還原菌能夠?qū)е滤虻乃嵝曰约傲蚧锏姆e累[65]。而水體pH值的改變會(huì)破壞貝類酸堿平衡，導(dǎo)致貝類更易感染病菌而大量死亡，破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡。

除自然因素外，人為活動(dòng)是造成水體缺氧的主要原因。近年來(lái)，由于經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與市場(chǎng)需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化程度越來(lái)越高，規(guī)模越來(lái)越大，由此造成的水體富營(yíng)養(yǎng)化使貝類因缺氧大量死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此應(yīng)當(dāng)采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施，減小海洋缺氧區(qū)域面積，維護(hù)海洋生態(tài)健康，促進(jìn)人與自然的和諧相處。除此之外，研究貝類在缺氧環(huán)境中的免疫應(yīng)答具有重要的實(shí)踐意義。相關(guān)的研究已有很多報(bào)道，但細(xì)胞免疫與體液免疫之間的協(xié)同關(guān)系以及不同細(xì)胞之間的協(xié)作機(jī)制尚不明確，與其他環(huán)境因子(如藻毒素、有機(jī)污染物等)共同對(duì)貝類造成影響的研究相對(duì)較少，貝類抗逆基因的篩選與抗逆、抗病品種的培育等都是這方面研究的新方向。