付 穎，文 雯，魏江平，陳 歡，文躍強(qiáng)，徐世軍＊＊

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 成都 611137；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病藥物整合轉(zhuǎn)化研究所成都 611137；3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 成都 611137）

線粒體作為細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，在細(xì)胞能量代謝中起重要作用。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整是維持氧化磷酸化及產(chǎn)生ATP 的先決條件[1-2]。線粒體對(duì)腦缺血缺氧異常敏感，缺血缺氧會(huì)使大腦葡萄糖攝入減少，線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性下降，功能障礙甚至結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦內(nèi)產(chǎn)能不足[3-4]，可直接誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡或壞死進(jìn)而導(dǎo)致。血管性癡呆（vascular dementia，VD）指是由缺血缺氧引起的腦血管病變所致的學(xué)習(xí)及記憶功能下降[5-6]。線粒體損傷是VD 的重要病理特征，也是加重腦血管損傷和記憶障礙的重要環(huán)節(jié)。因此，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整，維持腦能量供應(yīng)，增強(qiáng)缺血缺氧受損區(qū)域?qū)θ毖鯒l件的耐受力，以維持神經(jīng)細(xì)胞的存活在VD 防治中具有重要地位。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidyl alcohol kinases/protein kinase B，PI3K/AKT)信號(hào)通路不僅與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)，而且在線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。芎歸不忘散(XGBWS)是由加味芎歸湯與開心散組合而成，具補(bǔ)心益智，行氣活血的功效，現(xiàn)有研究表明加味芎歸湯和開心散單獨(dú)使用對(duì)阿爾茨海默癥及VD 均具有一定的治療作用[11-12]。然而，關(guān)于加味芎歸湯與開心散進(jìn)行合方用于治療痰淤釀毒，毒損腦絡(luò)所致的VD 還尚未報(bào)道，故本研究擬探索兩者合方后對(duì)VD 的治療作用及其對(duì)PI3K/AKT信號(hào)與線粒體保護(hù)的影響。

1 材料與儀器

1.1 藥物

川芎、當(dāng)歸、黃芩、石菖蒲、茯苓、遠(yuǎn)志、人參均購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定為符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，劑量比例根據(jù)中國(guó)ZL201310128021.7 加味芎歸湯與《備急千金藥方》開心散確定，藥材用8 倍量的純凈水浸泡1 h 后煎煮3次，每次煎煮1 h，合并煎液，過濾，合并藥液并濃縮至325ML 得率為32.5%濃度即為0.23 g?ml-1，4℃保存。甲磺酸雙氫麥角毒堿片（喜得鎮(zhèn)），天津華津制藥有限公司，批號(hào)：7C883T。

1.2 動(dòng)物

60 只SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體重180-220 g，于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購買，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：NO.51203500003215。

1.3 試劑

ATP(1001665433，sigma)；ADP(1001726877，sigma)；AMP(101606467，sigma)；Mitochondrial Membrane Potential DetectionJC-1 Kit（551302，BD）；PI3K Rabbit mAb（4257S，Cell Signaling Technology）；AKT Rabbit mAb（4685S，Cell Signaling Technology）；p-PI3K Antibody（4228S，Cell Signaling Technology）；p-AKT Rabbit mAb（4060S，Cell Signaling Technology）；PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT抗體稀釋比例均為1∶1000。

1.4 主要儀器

Morris 水迷宮分析系統(tǒng)（WMT-100，成都泰盟科技有限公司），高效液相色譜儀（1260，Agilent），流式細(xì)胞儀（ZE5，Bio-Rad 公司），Champchemi 610Plus 全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），ODSHYPERSIL C18色譜柱（thermo）。

2 方法

2.1 模型制備及分組

采用微血栓栓塞法制備VD 大鼠模型[12]。待模型大鼠恢復(fù)2 周后，根據(jù)“Y”迷宮結(jié)果篩選出記憶障礙大鼠隨機(jī)分成4 組，每組10 只，分別為模型組(Model)、喜得鎮(zhèn)組(Hydergine，0.7mg/kg）、芎歸不忘散高劑量組(XGBWS H，2.12g?kg-1）、芎 歸 不 忘 散 低 劑 量 組（XGBWS L，1.06 g?kg-1），每組10只。另取10只假手術(shù)大鼠作為假手術(shù)對(duì)照組（Sham），按10 g?kg-1，每日1次，給予對(duì)應(yīng)藥物45 天，其中假手術(shù)對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相應(yīng)量的生理鹽水。本論文的給藥劑量配伍比例是源自于中國(guó)ZL201310128021.7 加味芎歸湯與《備急千金藥方》開心散公開的劑量配比，同時(shí)參照《中國(guó)藥典》藥材使用量確定本論文的大鼠給藥劑量，本論文的給藥時(shí)間是結(jié)合前期的工作基礎(chǔ)及已發(fā)表論文“開心散對(duì)多發(fā)梗死性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及ATP/AMP的影響”確定給藥時(shí)間。

2.2 大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行定向航行和空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄動(dòng)物逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)；空間探索測(cè)試結(jié)束后于無菌環(huán)境處死大鼠，于冰上分離海馬，用4%多聚甲醛固定海馬，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE 染色、封片，顯微鏡下觀察海馬CA1神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)。

2.3 海馬線粒體腫脹度、膜電位和能荷檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體腫脹度和膜電位[13]。取適量海馬制成細(xì)胞懸液，離心、棄上清、重懸、孵育，清洗、重懸混勻后上機(jī)檢測(cè)線粒體膜電位及線粒體腫脹；取適量海馬，制樣，采用HPLC 法檢測(cè)海馬ATP、ADP、AMP 含量[14]，并根據(jù)公式計(jì)算能荷值：EC =([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])。

2.4 大鼠海馬PI3K和AKT表達(dá)測(cè)定

取適量海馬，制樣、凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗于4℃孵育過夜，用TBST 洗膜，重復(fù)洗3 次，于室溫孵育二抗90 min，重復(fù)洗膜3 次。ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 芎歸不忘散對(duì)VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

如圖1所示，隨著訓(xùn)練時(shí)間，各組動(dòng)物逃避潛伏期均有不同程度縮短，但模型組相較于假手術(shù)組縮短時(shí)間較少。在檢測(cè)日，與模型組比較,芎歸不忘散高、低劑量組逃避潛伏期顯著縮短，其中高劑量組(F =25.85；P = 0.0071)，低劑量組（F = 24.36；P = 0.0078）；高低劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.01)。

圖1 XGBWS對(duì)VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

圖2 XGBWS對(duì)VD型大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)影響

3.2 芎歸不忘散對(duì)VD模型大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)影響

如圖2 所示，與模型組相比，經(jīng)過干預(yù)后，芎歸不忘散明顯改善VD 模型大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞固縮等病理變化（P<0.05）。

3.3 芎歸不忘散對(duì)VD模型大鼠海馬線粒體腫脹度及膜電位的影響

如圖3所示，與模型組相比較，芎歸不忘散高劑量組顯著下調(diào)線粒體腫脹度(P < 0.05)，高、低劑量均能顯著上調(diào)線粒體膜電位(P<0.05)。

3.4 芎歸不忘散對(duì)VD模型大鼠線粒體功能的影響

由圖4 所示，與模型大鼠比較，芎歸不忘散高、低劑量能顯著提高海馬內(nèi)能荷及ATP 含量（P < 0.05），AMP和ADP的含量無明顯變化（P>0.05）。

3.5 芎歸不忘散對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

由圖5 可知，與模型組比較，芎歸不忘散高、低劑量均顯著提高VD 模型大鼠p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)（P<0.05）。

4 討論

圖3 XGBWS對(duì)VD模型大鼠海馬線粒體的影響

VD 是由缺血缺氧性腦血管疾病等腦血管異常引起的一種認(rèn)知功能損傷綜合征，臨床多表現(xiàn)多為記憶功能衰減或認(rèn)知功能下降及海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元病變[14-18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，VD 模型大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少明顯、神經(jīng)細(xì)胞壞死明顯增多、細(xì)胞排列不整齊。經(jīng)過XGBWS 干預(yù)后，VD 模型大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多，明顯減緩海馬CA1區(qū)不同程度病理變化，說明XGBWS 可顯著改善VD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)病理情況。

圖4 XGBWS對(duì)VD模型大鼠海馬線粒體功能的影響

圖5 XGBWS對(duì)VD模型大鼠腦PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

ATP 作為機(jī)體直接能源物質(zhì)，而ADP、AMP 是ATP不完全水解產(chǎn)物，機(jī)體通過不斷進(jìn)行ADP-ATP再循環(huán)完成能量的穿梭轉(zhuǎn)換。能荷則是代表總的腺苷酸系統(tǒng)中所負(fù)荷的高磷酸基數(shù)量，對(duì)代謝起著重要調(diào)控作用。因此能荷、ATP、ADP、AMP 含量均能反映線粒體功能。線粒體膜電位與線粒體大小均是反映線粒體結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。已有研究表明線粒體功能損傷、能量代謝失常是VD 的發(fā)病機(jī)制[19-21]。本次研究結(jié)果表明，VD 模型大鼠海馬中ATP 含量及能荷值均降低，且線粒體腫脹變性、膜電位下降。經(jīng)XGBWS 干預(yù)后，模型大鼠腦線粒體腫脹度顯著降低，膜電位下降得到改善，能荷、ATP 含量顯著增加，ADP、AMP 含量基本不變。提示XGBWS 修復(fù)VD 模型大鼠線粒體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)而達(dá)到改善線粒體功能的目的，即XGBWS對(duì)線粒體具有保護(hù)作用。

然而，線粒體功能由多種因素共同調(diào)控，其中PI3K/AKT 信號(hào)通路在線粒體保護(hù)及能量代謝中扮演著重要角色[22-23]。已有研究表明多種VD 動(dòng)物模型及細(xì)胞模型均顯示PI3K/AKT 信號(hào)通路呈抑制狀態(tài)[24]，這與本研究結(jié)果一致，通過XGBWS 干預(yù)后，可以激活PI3K/AKT 信號(hào)，上調(diào)p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)。綜上，XGBWS 明顯改善VD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，其作用機(jī)制可能是通過激活PI3K/AKT 信號(hào)通路達(dá)到保護(hù)或修復(fù)受損的線粒體，進(jìn)而達(dá)到改善腦能量的目的。