于旭東，劉蕊嘉，王繼升，鄧 省，鮑丙豪，商建偉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京 100700）

1 研究背景

勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED），是指在性行為過程中陰莖無法達(dá)到或維持足夠良好的勃起[1]。本病不僅使患者性功能低下，而且降低其生活質(zhì)量，同時(shí)也是心血管疾病的預(yù)警信號(hào)。隨著當(dāng)前社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，中青年一代壓力與日俱增，流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿?。―iabetes mellitus，DM）患者的ED 發(fā) 病 率 達(dá) 到35%-90%[2]，是 非DM 人 群 的1.9-4倍[3-5]。糖尿病性勃起功能障礙（Diabetes-induced erectile dysfunction，DIED）的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的病理生理學(xué)過程，涉及血管內(nèi)皮功能、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的改變等多因素。其中陰莖海綿體血管平滑肌舒張能力的下降被認(rèn)為是引起勃起功能障礙的關(guān)鍵因素之一。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)平滑肌的收縮能力也是決定陰莖勃起功能的重要因素，其中代表性的信號(hào)通路RhoA/Rho是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。

當(dāng)前對(duì)于DIED 的治療方法主要包括口服PED-5抑制劑、假體植入、負(fù)壓吸引等，然而這些治療手段都具有一定的副作用和局限性，口服PED-5 抑制劑類藥物治標(biāo)難治本，存在依賴性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)等不足之處，外科手術(shù)治療的適應(yīng)癥有限，且療效一直備受爭(zhēng)議[6]。中醫(yī)藥治療DIED 有一定療效，中醫(yī)理論認(rèn)為DIED 最主要的病機(jī)是腎虛血瘀，因此，填精通絡(luò)方在臨床一線中具有良好的應(yīng)用效果，該方由仙靈脾、熟地、水蛭、川牛膝組成。仙靈脾和熟地補(bǔ)腎養(yǎng)血，填精益髓，水蛭和川牛膝活血通經(jīng)逐瘀?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，這些藥物具有改善血管內(nèi)皮功能、修復(fù)內(nèi)皮損傷的功效[7-8]。因此，本研究以陰莖海綿體血管平滑肌的收縮功能為切入點(diǎn)，觀察填精通絡(luò)方治療DIED 模型大鼠勃起功能的療效及其對(duì)RhoA/Rho 信號(hào)通路的影響，探索填精通絡(luò)方的部分機(jī)制。

2 材料和方法

2.1 藥物和試劑

實(shí)驗(yàn)所需藥物主要包括造模藥物和實(shí)驗(yàn)干預(yù)藥物，其中造模使用的鏈脲佐菌素（STZ）和阿樸嗎啡（APO）從中國(guó)上海Sigma-Aldrich 公司統(tǒng)一購(gòu)置。實(shí)驗(yàn)干預(yù)所用陽性對(duì)照藥他達(dá)拉非從Eli Lilly and Company購(gòu)入，溶解后在適宜環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 中藥的制備

所用中藥顆粒來自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院（中國(guó)北京）。填精通絡(luò)方的藥物組成包括：熟地黃10g、仙靈脾15g、川牛膝10g、水蛭10g。制備工藝：中藥飲片經(jīng)單味提取、濃縮、干燥、制粒而成顆粒型，具體單味藥顆粒型的制備工藝流程由北京同仁堂有限公司統(tǒng)一進(jìn)行，填精通絡(luò)方將已加工成顆粒狀的相應(yīng)藥物按比例調(diào)配在一起完成中藥的制備。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由東直門醫(yī)院藥物質(zhì)檢部門統(tǒng)一檢驗(yàn)合格后購(gòu)入。顆粒劑購(gòu)入后制備為溶解液將顆粒溶于蒸餾水中，濃度為700 mg/kg 灌胃，溶解后在適宜環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 動(dòng)物和治療

2.3.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠，8 周齡，體重（230±50）g，購(gòu)自北京維通利華驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（合格證號(hào)NO.SYXK（京）2012-0001，北京，中國(guó)）。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，提供標(biāo)準(zhǔn)食物和水。北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物與人類倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了這項(xiàng)研究。

2.3.2 建立DIED大鼠模型

SD 大鼠禁食12 小時(shí)用STZ 溶液以腹腔注射的方式進(jìn)行DIED 大鼠模型的建立。72 小時(shí)后，第1 周和第2周各從大鼠的尾靜脈取血檢測(cè)即時(shí)血糖水平。每次的檢測(cè)結(jié)果>16.7 mmol/L，同時(shí)記錄各組大鼠每日排尿情況和飲食情況，兩者較前均增加則表明造模成功。根據(jù)Heaton的方法[9]，將DM大鼠稱重并放置在透明的玻璃箱中，光線暗到僅供觀察，房間保持安靜。在適應(yīng)環(huán)境15分鐘后，每只大鼠在頸部皮膚松弛處注射APO100 μg/kg 并觀察30 分鐘。陰莖增大，包皮回縮，龜頭陰莖充血，陰莖末端出現(xiàn)稱為陰莖勃起。如果勃起次數(shù)≥1，則認(rèn)為勃起試驗(yàn)陽性。血糖> 16.7 mmol/L且勃起試驗(yàn)陰性的大鼠為DIED造模成功。

2.3.3 治療

實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行5 天的適應(yīng)性喂養(yǎng)，之后隨機(jī)選擇10 只作為正常組，其余進(jìn)行DIED 造模。其余造模成功的大鼠分為三組：模型組（DIED 組）（n=10）、對(duì)照組（他達(dá)拉非組）（n10）和填精通絡(luò)組（n=10）。在隨后的4周中，對(duì)照組的大鼠每天灌胃0.2 mg/kg他達(dá)拉非，填精通絡(luò)組大鼠通過灌胃每天灌胃9.3 g/kg 填精通絡(luò)中藥。對(duì)照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水。每周稱量大鼠，每天觀察它們的健康狀況。

2.4 勃起功能評(píng)估

藥物干預(yù)4 周后，對(duì)各組大鼠陰莖勃起次數(shù)和勃起潛伏時(shí)間進(jìn)行測(cè)試。具體方法是每只大鼠皮下注射APO，記錄30分鐘內(nèi)勃起次數(shù)和勃起潛伏期。如果沒有勃起，潛伏期記為30分鐘。

2.5 組織的制備

治療結(jié)束后稱重大鼠并用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹膜內(nèi)）麻醉。從每只大鼠取出陰莖組織并用冷鹽水洗滌并用10%布因氏溶液固定24小時(shí)。脫水后，石蠟包埋，4-5μm 切片，蘇木精和伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察HE 染色的載玻片（BK-FL4，OPTEC，重慶，中國(guó)）。

2.6 Western Boltting

為檢測(cè)RhoA、ROCK1和ROCK2，取出每只大鼠的海綿體組織的一部分，在冰冷的組織裂解緩沖液中勻漿。將混合物以12000 rpm 離心10 分鐘后收集上清液。使用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用RIPA 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度并煮沸5 分鐘。每個(gè)樣品用10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。稀釋比例分別為RhoA（1∶300）、ROCK1（1∶300）和ROCK2（1∶300）（BIOSS，北京，中國(guó)）。以βactin 作為內(nèi)參（ImmunoWay Biotechnology Company，USA）進(jìn)行免疫印跡，4℃水平搖床孵育過夜。第二天將二抗稀釋后在室溫下孵育30分鐘，使用ECL檢測(cè)系統(tǒng)（Millipore，USA）檢測(cè)免疫反應(yīng)信號(hào)。

表1 靶基因的實(shí)時(shí)PCR引物序列

表2 各組大鼠治療后勃起行為的比較

2.7 PCR檢測(cè)RhoA，ROCK1和ROCK2 mRNA

用Trizol（TaKaRa Biotechnology，大連，中國(guó)）將海綿體組織勻漿。使用RNA 樣品的OD260/OD280 比率評(píng)估RNA的質(zhì)量。根據(jù)制造商的說明使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa Biotechnology，Dalian，China）將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。靶基因的實(shí)時(shí)PCR 引物序列如表1。

使用DNA 結(jié)合染料SYBRGreen 通過ABI 7500 系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA，USA）進(jìn)行cDNA 的擴(kuò)增。使用GAPDH 作為內(nèi)部參照基因，并使用2-ΔΔCt 方法評(píng)估RhoA，ROCK1和ROCK2 mRNA表達(dá)的變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有來自本研究的計(jì)量數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差。若數(shù)據(jù)符合正太分布，各組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布情況下，若滿足方差齊性，則使用單因素方差分析（ANOVA）分析組間差異，若不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)法，P<0.05表示差異顯著。

表3 各組大鼠治療前后血糖比較（mmol/L，±s）

表3 各組大鼠治療前后血糖比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P<0.01；與他達(dá)拉非組比較，#P<0.01

組別正常組模型組他達(dá)拉非組填精通絡(luò)組n 10 10 10 10治療前4.3±0.3 22.1±1.9 23.5±2.0 23.7±1.6治療后4.2±0.4 23.6±2.2 24.8±1.0 18.8±1.3*#

3 結(jié)果

3.1 填精通絡(luò)方對(duì)各組SD大鼠勃起行為的影響

結(jié)果如表2、圖1 顯示，與模型相比，對(duì)照組（他達(dá)拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡(luò)組陰莖勃起次數(shù)顯著增加，潛伏期縮短（P<0.01 和P<0.05）。對(duì)照組和填精通絡(luò)組之間沒有顯著差異。

3.2 填精通絡(luò)方對(duì)各組SD大鼠血糖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，填精通絡(luò)方能明顯降低大鼠血糖水平。填精通絡(luò)組治療后血糖均顯著低于治療前血糖（P < 0.01）。與模型組比較，填精通絡(luò)組的血糖明顯降低（P<0.01）；與他達(dá)拉非組比較，填精通絡(luò)組的血糖明顯降低（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

3.3 填精通絡(luò)方對(duì)DIED大鼠組織病理學(xué)的影響

圖1 各組大鼠治療后勃起行為的比較

圖2 各組大鼠陰莖海綿體HE染色結(jié)果（×40；×100，n=3）

正常組陰莖海綿竇毛細(xì)血管豐富，呈網(wǎng)狀交織，未見明顯的陰莖海綿體間隔，可見大量不規(guī)則血竇間隙，血竇、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)組織及微血管腔結(jié)構(gòu)清晰，血竇間隙表面附有扁平的內(nèi)皮細(xì)胞，血竇小梁含有大量平滑肌細(xì)胞及膠原纖維。模型組（DIED 組）陰莖海綿體間隔明顯，陰莖海綿體血竇、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞分布雜亂，陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性破壞，膠原纖維密度增加，間質(zhì)組織大量增生、排列紊亂，血管壁增厚，呈纖維樣變，管腔變小或閉塞，提示血管破壞，紅細(xì)胞數(shù)目減少，同時(shí)可見結(jié)締組織增生，如箭頭所指部位細(xì)胞連續(xù)性受到破壞，排列紊亂。對(duì)照組（他達(dá)拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡(luò)組（REDCF 組）陰莖海綿體血管中紅細(xì)胞數(shù)目較模型組增多，但結(jié)締組織差異不明顯，病理變化介于兩者之間，如箭頭所指部位對(duì)照組與填精通絡(luò)組治療后組織結(jié)構(gòu)較模型組改善明顯，見圖2。

3.4 填精通絡(luò)方對(duì)DIED 大鼠RhoA，ROCK1 和ROCK2 mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)海綿體相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平見圖3。與空白組相比，模型組（DIED 組）、對(duì)照組（他達(dá)拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡(luò)組（REDCF 組）RhoA，ROCK1 和ROCK2 的mRNA 水平顯著 升 高（P < 0.01 和P < 0.05）。與DIED 組 相 比，Tadalafil 組 和REDCF 組RhoA，ROCK1 和ROCK2 mRNA 的 表 達(dá) 顯 著 降 低（P < 0.01 和P < 0.05）。Tadalafil組與REDCF組之間無顯著差異。

3.5 填精通絡(luò)方對(duì)DIED 大鼠RhoA，ROCK1 和ROCK2蛋白表達(dá)的影響

如圖4 所示，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組（他達(dá)拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡(luò)組（REDCF 組）的RhoA，ROCK1 和ROCK2 蛋白水平低顯著低于模型組（DIED組）（P < 0.01 和P < 0.05）。RhoA 蛋白水平高于對(duì)照組（P < 0.01）。對(duì)照組（他達(dá)拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡(luò)組（REDCF 組）之間RhoA，ROCK1 和ROCK2蛋白表達(dá)無顯著性差異。

4 討論

圖3 各組大鼠RhoA，ROCK1和ROCK2 mRNA表達(dá)水平

圖4 各組大鼠RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

腎精虧虛、脈絡(luò)瘀阻貫穿DIED 發(fā)生發(fā)展的始終，在治療上以補(bǔ)腎活血、填精通絡(luò)為主要原則。辨證施治的時(shí)需在補(bǔ)腎活血，填精通絡(luò)的前提下，再根據(jù)不同的證型具體的臨證加減藥物及其用量?！皻鉃檠畮?，血為氣之母。”氣虛則難以推動(dòng)血行，導(dǎo)致氣虛血瘀，脈絡(luò)瘀阻。使得宗筋不得氣血之濡養(yǎng)，則發(fā)為陽痿。所謂“腎虛必致血瘀，瘀血必歸于腎”，是因?yàn)檠雒}絡(luò)而導(dǎo)致腎精化生不暢。因此，DIED 在治療上應(yīng)以補(bǔ)腎活血，填精通絡(luò)為主要的治療方法，腎精得補(bǔ)，瘀血得散才能使得腎中精氣化生有源，宗筋得以氣血濡養(yǎng)，方能起痿。

臨床上，本研究發(fā)現(xiàn)填精通絡(luò)方在治療DIED 上有著良好的效果，不僅能過改善患者勃起功能，還能明顯輔助降低患者血糖。研究表明DIED 的嚴(yán)重情況和血糖控制情況是密切的，DIED 的治療是以控制血糖為基礎(chǔ)的，防止糖尿病對(duì)血管、神經(jīng)的進(jìn)一步損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，填精通絡(luò)組治療后血糖均顯著低于治療前血糖，但血糖降低的幅度并不大，可見在治療DM的時(shí)候，還是其他輔助方式來治療DM。

目前，在實(shí)驗(yàn)研究方面，ED 的研究主要集中在海綿體和血管平滑肌舒張功能的減弱上。實(shí)際上，良好的陰莖勃起還取決于收縮功能。在松弛狀態(tài)下，海綿體和血管平滑肌的收縮是主要的；而在勃起狀態(tài)下，其松弛是主要的。陰莖必須首先克服平滑肌的收縮力才能完全勃起。因此，海綿體和血管平滑肌收縮功能增強(qiáng)也是誘導(dǎo)ED 發(fā)生的重要機(jī)制[10-11]。2001 年，Chitaley 等[9]首次發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體組織中表達(dá)內(nèi)源性Rho 激酶（ROCK）。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶途徑參與DIED 發(fā)生[12-13]。該通路中的RhoA 是一種小分子的GTP 結(jié)合蛋白，屬于Ras 相關(guān)的Rho 家族，主要以非活化的狀態(tài)與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate,GDP）結(jié)合，是無活性的GDP 與活性的GTP 的分子開關(guān)。Rho 激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有兩種亞型：ROCK1、ROCK2，它們可以增高胞漿內(nèi)Ca2+濃度，使胞漿中的Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，活化肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），使其磷酸化，導(dǎo)致肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白發(fā)生交聯(lián)，最終引起平滑肌的收縮[14-15]。同時(shí)，RhoA/Rho 激酶通路可通過抑制eNOS 的磷酸化從而減少NO的產(chǎn)生，進(jìn)而減弱平滑肌的舒張功能。

本實(shí)驗(yàn)所采用的STZ注射造模，是經(jīng)典的DIED造模方法。根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選用50 mg/kg 的注射量，造模階段STZ 造模組與造?？瞻讓?duì)照組比較逐漸出現(xiàn)明顯多尿、多飲、多食、體重下降現(xiàn)象，體毛逐漸枯黃，無光澤，反應(yīng)逐漸遲鈍，這與中醫(yī)的“消渴”病癥狀相符；同時(shí)，對(duì)DM 大鼠使用APO 篩選后，成功選取勃起功能障礙大鼠，成功構(gòu)建DIED 大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)所采用的陽性對(duì)照藥物他達(dá)拉非是PDE5 抑制劑之一，臨床廣泛用于治療ED。研究證實(shí)PDE5-Is對(duì)Rho/ROCK 通路有影響。PDE-5 抑制劑可能通過幾種生物學(xué)機(jī)制改善癥狀，包括Rho 相關(guān)蛋白激酶失活的改變[16]。故本研究選擇了他達(dá)拉非作為陽性對(duì)照藥物。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，第一，本研究可以得出結(jié)論：STZ 造模的DIED 大鼠RhoA/Rho 激酶表達(dá)增加。第二，根據(jù)勃起行為的結(jié)果，填精通絡(luò)方和他達(dá)拉非干預(yù)后勃起功能增強(qiáng)。第三，填精通絡(luò)方治療改善了陰莖海綿體的形態(tài)學(xué)改變。第四，經(jīng)填精通絡(luò)方干預(yù)后，RhoA、ROCK1 和ROCK2 的表達(dá)顯著下降，可認(rèn)為填精通絡(luò)方改善DIED 大鼠勃起功能的機(jī)制之一可能是下調(diào)RhoA/Rho 激酶的表達(dá)。而且，根據(jù)DIED 組的結(jié)果，本研究可以發(fā)現(xiàn)他達(dá)拉非還具有降低RhoA/Rho通路的蛋白表達(dá)的功效。先前的研究已證實(shí)PDE5-Is對(duì)Rho/ROCK 通路有影響，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并且此研究進(jìn)一步證明了RhoA，ROCK1 和ROCK2 參與介導(dǎo)該過程。在勃起時(shí)，RhoA/Rho 通路被抑制，從而引起海綿體平滑肌舒張?jiān)鰪?qiáng)和收縮減弱。相反地，RhoA/Rho通路的激活抑制海綿體平滑肌的舒張功能并促進(jìn)收縮功能，最終導(dǎo)致勃起功能障礙[17]。因此，RhoA/Rho蛋白的高表達(dá)意味著平滑肌舒張功能的下降與收縮能力的增強(qiáng)，也就是勃起功能的減弱。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，填精通絡(luò)方改善了由STZ構(gòu)建的DIED 大鼠的勃起功能，其作用機(jī)制可能是下調(diào)RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白在RhoA/Rho 通路中的表達(dá)，為RhoA/Rho 成為治療DIED 的新靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。