康 愷，楊 丹，黃至誠，張詩敏，方婷婷，江 茵，吳 江

塑料由于具有較強的可塑性及其低成本、耐水、耐高溫等特性被廣泛應用于各個領域。全球塑料年產(chǎn)量逐年增加，按照目前的需求、生產(chǎn)速度，Rochman等[1]估計到2050年全球的塑料制品產(chǎn)量可能達到330億t。常見的塑料成分包括聚氯乙烯（PVC）、聚碳酸酯（PC）、聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）等，這些塑料廣泛用于我們的生活當中，使用后的塑料垃圾排放于環(huán)境后由光熱降解、生物降解、機械磨損等途徑進入環(huán)境中形成粒徑小于5 mm的微塑料[2]。Browne等[3]調查橫跨六大洲海岸，包括澳大利亞、日本、阿拉伯聯(lián)合酋長國、菲律賓等世界各地18個地點均發(fā)現(xiàn)微塑料污染，連人跡罕至的南極也不例外[4]。微塑料也被報道在淡水、土壤、空氣中檢出，海洋污染更甚[5-8]，由于微塑料體積較小且廣泛分布于水體和土壤環(huán)境中，極易被生物采食而進入食物鏈中。

海洋中有多種海洋生物例如藻類、貝類及一些海洋哺乳類動物直接或間接地將微塑料攝入體內(nèi)并進一步累積[9-11]，從而影響生物的各項生理及生化指標，對機體造成一定的毒性與傷害。大量的研究報道了水體污染的微塑料對水生生物造成的機體損害。體內(nèi)的微塑料影響了中華絨螯蟹的免疫酶活性和免疫相關基因表達，改變了腸道菌群的多樣性和組成[12]；改變一些浮游生物的行為特性[13]；改變斑馬魚肝臟酶的活性從而加重體內(nèi)重金屬離子的富集，進一步加重毒性作用[14]、導致斑馬魚代謝紊亂及微生物菌群的失調[15]；導致金魚胃腸道系統(tǒng)的損害[16]；對海蝦的腸道上皮細胞造成破壞，導致微絨毛數(shù)量減少、排列紊亂，細胞內(nèi)線粒體和自噬體增加[17]。也有報道表明，微塑料對人的Caco-2細胞系有明顯的毒性作用，并抑制細胞膜離子泵的外排作用[18]?？梢酝茰y出經(jīng)由食物鏈，微塑料最終會進入陸生動物的體內(nèi)、產(chǎn)生積累甚至對動物臟器產(chǎn)生不可逆的傷害。本文以小鼠為試驗對象，通過飼喂摻雜微塑料的鼠糧，觀察微塑料對小鼠生長和腸道結構的影響，以判斷食源性微塑料是否會對哺乳動物消化系統(tǒng)造成功能障礙。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本實驗室自繁自養(yǎng)的清潔級昆明小白鼠，雌性，25只，體質量約23 g，30日齡。

1.2 微塑料

微塑料粉聚苯乙烯（PS）和聚乙烯（PE）購于邁森生物公司，過600目網(wǎng)篩。

1.3 小鼠的分組與飼養(yǎng)

挑選體質量相近的小鼠25只，隨機分為5組，每組5只。對照組飼喂正常鼠糧，其余4組為微塑料添加組，分別為PE（0.3%）組、PE（3%）組、PS（0.3%）組和PS（3%）組。小鼠飼喂27 d，每組小鼠定時定量投喂，每3 d添加120 g鼠餅，期間自由采食與飲水，小鼠日平均飲食6～8 g鼠餅。

1.4 鼠餅的制作

按表1配方制作對照組鼠餅，試驗組為添加不同劑量的微塑料組，0.3%添加組按3 g·kg-1鼠糧添加微塑料，3%添加組按30 g·kg-1鼠糧添加微塑料。

表1 鼠糧成分比例Table 1 Composition ratio of chow

1.5 小鼠體質量的檢測

分別在開始試驗的第1、9、18、27 d記錄小鼠體質量，檢測整個飼喂過程小鼠體質量的變化，并計算平均每組小鼠的體質量差值與相對體質量差值。體質量差（g）=終末體質量（g）-初始體質量（g）；相對體質量差=[終末體質量（g）-初始體質量（g）]/初始體質量（g）。

1.6 小鼠的剖檢與腸道樣品采集

于飼喂第27 d將各組小鼠進行剖檢，觀察小鼠腸道有無病理變化，每組取3只小鼠分別采集十二指腸、空腸、回腸各5 mm左右，生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，放入裝有4%甲醛固定液的EP管中備用。

1.7 組織切片的制備

組織塊樣品流水沖洗14 h，經(jīng)酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片和粘片后，HE染色，樹脂封片。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各組內(nèi)數(shù)據(jù)計算平均值與誤差，試驗處理組與對照組采用t檢驗進行兩兩比較分析。

2 結果與分析

2.1 微塑料顆粒大小

顯微鏡觀察微塑料顆粒，大小較均一，微塑料顆粒在20μm左右（圖1）。

2.2 小鼠體質量變化趨勢

在整個小鼠飼喂周期內(nèi)，采取定時投料，即每隔3 d投鼠料一次，每次120 g，期間小鼠自由采食，每只小鼠的日進食量在6～8 g左右。對照組與微塑料添加組各小鼠飲食均正常，糞便正常，未見厭食、食欲不振等現(xiàn)象。稱量飼喂周期內(nèi)各組小鼠的體質量，結果表明（圖2）：對照組各小鼠體質量均呈逐漸增長趨勢；微塑料添加組在飼喂的前9 d，大部分體質量有所增長，但在后續(xù)的時間大部分小鼠出現(xiàn)體質量停滯甚至下降的現(xiàn)象。

2.3 小鼠體質量增長差

圖2 小鼠體質量變化趨勢Figure 2 Trends of mice weight chang

對照組小鼠在飼喂周期內(nèi)體質量逐漸增長，平均體質量增加7.34 g，微塑料添加組與對照組相比體質量增長緩慢，出現(xiàn)停滯，甚至呈下降趨勢（圖3a），其中PE（0.3%）組體質量平均增加1.84 g，PE（3%）組小鼠平均體質量減少0.12 g，PS（0.3%）組小鼠平均體質量增加0.86 g，PS（3%）組小鼠平均體質量增加0.16 g，各微塑料添加組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。微塑料添加組相對體質量增長差也極顯著小于對照組（P＜0.01）（圖3b）。

圖1 微塑料大小Figure 1 The size of mcroplastic particles

2.4 小鼠小腸組織形態(tài)觀察

小鼠剖檢，所有組別的小鼠小腸均無肉眼可見的病理變化。腸道內(nèi)容物顏色、狀態(tài)無異常。

2.5 微塑料對小鼠十二指腸結構的影響

對照組小鼠十二指腸切片在光學顯微鏡下可見小腸絨毛細長，排列整齊，刷狀緣清晰，上皮細胞完整呈柱狀，杯狀細胞較多且均勻分布，隱窩深度適中，形態(tài)結構清晰（圖4a、圖4b）。與對照組相比，PE（0.3%）組小鼠的十二指腸切片中可清晰看到小腸絨毛細長但破裂，上皮細胞形態(tài)結構完整，杯狀細胞數(shù)量減少，隱窩形態(tài)結構基本完好但深度變深（圖4c）。PE（3%）組小腸絨毛長度變短，頂端破裂（圖4d箭頭處），杯狀細胞數(shù)量減少，隱窩形態(tài)不清晰、數(shù)量減少。PS（0.3%）組十二指腸絨毛大部分形態(tài)結構消失，絨毛變短，杯狀細胞數(shù)量減少，有少量結構完整的隱窩（圖4e、f）。PS（3%）組小腸絨毛明顯變矮且部分小腸絨毛結構形態(tài)消失，杯狀細胞數(shù)量減少，隱窩形態(tài)結構基本完整但數(shù)量減少（圖4g、圖4h），黏膜基層有顆粒物聚集（圖4h箭頭處）。

2.6 微塑料對小鼠空腸結構的影響

圖3 小鼠體質量增長差與相對體質量增長差Figure 3 Weight increaseand relative weight increase of mice

對照組小鼠空腸在顯微鏡下觀察，小腸絨毛細長排列整齊，上皮細胞形態(tài)結構完整清晰，杯狀細胞均勻分布且數(shù)量較多，隱窩形態(tài)結構清晰（圖5a、b）。與對照組對比，PE（0.3%）組小鼠空腸小腸絨毛斷裂，杯狀細胞數(shù)量減少，隱窩形態(tài)結構完整且數(shù)量較多，內(nèi)含未知顆粒（圖5c）。PE（3%）組小腸絨毛變矮、腫脹，杯狀細胞數(shù)量減少，但隱窩結構清晰，深度適中（圖5d、圖5e）。PS（0.3%）組小腸絨毛形態(tài)不清晰，黏膜固有層消失，上皮細胞形態(tài)結構完整，杯狀細胞減少（圖5f）。PS（3%）組小鼠空腸絨毛基本消失，無清晰形態(tài)結構，殘留有少部分上皮細胞，有少量隱窩但結構不清晰（圖5g），黏膜基層基本消失（圖5h）。

2.7 微塑料對小鼠回腸結構的影響

對照組小鼠回腸絨毛細長，排列整齊，刷狀緣清晰，上皮細胞完整呈柱狀，杯狀細胞較多，均勻分布（圖6a），但隱窩內(nèi)有顆粒物質（圖6b）。與對照組相比，PE（0.3%）組的回腸切片，小腸絨毛變矮，邊緣不清晰（圖6c），隱窩有未知顆粒（圖6d）。PE（3%）組回腸小腸絨毛高度差異不大，絨毛破損、融合，杯狀細胞萎縮，數(shù)量減少，隱窩結構不清晰（圖6e）。PS（0.3%）組小腸黏膜下層增生變厚（圖6f）。PS（3%）組小腸絨毛長度無太大變化但是形態(tài)改變，杯狀細胞數(shù)量減少，隱窩可見有未知顆粒（圖6g），腸道黏膜下層及肌層增生變厚（圖6h）。

3 討論

塑料制品在生活中的廣泛應用導致其降解后的微塑料污染已經(jīng)滲透到各個領域。中國國家海洋監(jiān)測局檢測得2016年我國海域渤海、東海、南海表層水漂浮微塑料數(shù)量密度為0.29個·m-2，海灘微塑料最高為1028個·m-2[19]。在國內(nèi)武漢漢江及長江流域、珠江流域、太湖、洞庭湖這些內(nèi)陸湖泊均檢出微塑料[20-23]。研究人員采集上海郊區(qū)的20個菜田土壤進行檢驗，這些土壤樣品中也均檢出微塑料[24]。微塑料不僅存在于環(huán)境中，在海洋生物體內(nèi)的報道更是不勝枚舉，最近報道在寵物犬和寵物貓的飼料和糞便中也都有檢出，在狗糧中微塑料PET檢出為1.5～12 μg·g-1，貓糧中檢出為1.5～4.6μg·g-1，在寵物狗糞便中的檢出則高達 7.7～190 μg·g-1，在貓糞便中高達 2.3～340 μg·g-1[25]?？梢娢⑺芰系臐B透以及污染早已不局限于海洋，環(huán)境微塑料終將通過食物鏈從海洋、土壤，經(jīng)生物富集進入食品并進入人體內(nèi)。

雖然微塑料在水生生物體內(nèi)的聚集以及生理毒性的報道已不在少數(shù)，但在哺乳動物體內(nèi)及其生物毒性的報道并不多。本研究利用小鼠飲食中添加微塑料來觀察攝入微塑料對小鼠的影響，結果表明在飼料中添加微塑料會使發(fā)育期小鼠在整個飼喂周期體質量增長顯著降低（P＜0.01），甚至體質量降低，并且體質量的增長與微塑料的攝入量成反比，但是對于兩種不同的微塑料（PS和PE）對體質量的增長影響并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異作用。而在開始的9 d飼喂周期中，我們發(fā)現(xiàn)，小鼠的體質量都是一個增長的狀態(tài)，體質量的降低出現(xiàn)在飼喂的中后期。這些結果表明，微塑料進入動物體內(nèi)會干擾動物的營養(yǎng)吸收，導致體質量降低，并且這種干擾作用需要時間的積累。有類似報道表明，黃魚攝入微塑料會減緩增長速度，并且體長增長速度與微塑料顆粒大小負相關[26]，對水溞的研究表明，微塑料的攝入會導致水溞行為的改變，包括生長增殖、趨光性以及繁殖行為的改變，顯著抑制生長速度，并導致父系水溞的死亡[13，27]。也有文獻表明微塑料的攝入會影響一些浮游生物的行為[13]。這些報道與本研究結果基本相符，但在本試驗觀察中，微塑料的攝入并沒有對小鼠的生理行為產(chǎn)生明顯的影響。飼喂過程中，小鼠精神狀態(tài)正常，飲食、飲水、活動均沒有表現(xiàn)出任何異常。但也有報道表明，貝母持續(xù)暴露在微塑料養(yǎng)殖環(huán)境中并不會產(chǎn)生任何生理影響，包括體質量增長和繁殖行為[28]?？梢娢⑺芰蠈Σ煌锓N或許有不同的影響。

圖4 小鼠十二指腸切片F(xiàn)igure 4 Duodenumsections of mice

圖5 小鼠空腸切片F(xiàn)igure 5 Jejunumsections of mice

圖6 小鼠回腸切片F(xiàn)igure 6 Ileumsections of mice

為了觀察微塑料對小鼠腸道結構的影響，解剖小鼠后發(fā)現(xiàn)，整個腸道并沒有眼觀的明顯病變，腸道內(nèi)容物的性狀也正常。但是在腸道的顯微結構觀察中，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，添加不同微塑料的小鼠腸道結構均有不同程度的改變，如腸絨毛腫脹、變短、杯狀細胞減少、黏膜下層增生等現(xiàn)象，并且在腸道隱窩結構以及黏膜下層觀察到聚集的顆粒，其顆粒大小與微塑料粒徑相符。腸絨毛的高度與小腸的吸收能力呈正比。杯狀細胞分泌的黏蛋白，對腸道有潤滑和保護的作用而且還可以防止微生物入侵腸上皮細胞與隱窩。隱窩的深淺也與腸道分泌、消化、吸收息息相關。在所有添加微塑料的組別中均出現(xiàn)小腸絨毛變短、隱窩形態(tài)結構異常、杯狀細胞數(shù)量減少。從部分小鼠的體質量不升反降可看出，這些結構的改變會使得腸道的消化與吸收能力減弱，對生物體造成損害。Deng等[29]采用熒光技術和原始聚苯乙烯微塑料，研究了微塑料在小鼠體內(nèi)的組織分布、積累，結果表明微塑料會在小鼠的肝臟、腎臟和腸道中積累，并且加劇有機磷阻燃劑（OPFRs）對小鼠體內(nèi)的生物毒性，造成代謝組學的嚴重紊亂[30]。體內(nèi)聚集的微塑料也會導致小鼠腸道菌群的紊亂，肝臟代謝的異常與脂代謝的紊亂[31]。鑒于本研究結果與已有的報道，有理由推測，微塑料在小鼠腸道的聚集以及對腸道顯微結構的破壞影響了小鼠的生理特性，造成小鼠的生長增殖過程中出現(xiàn)體質量減輕。究竟積累的微塑料是否對小鼠還有其他的生物毒性作用還需進一步研究。

目前已有多篇文獻報道微塑料在海洋食物鏈中轉移和富集[32]，但是依然鮮有報道在哺乳動物以及人體內(nèi)的轉移和毒性作用，水產(chǎn)品和畜產(chǎn)品的食用將是微塑料進入食物鏈的一個重要的途徑，相關試驗數(shù)據(jù)還需要大量積累補充。

4 結論

（1）飼料微塑料的攝入會聚集在小腸，破壞小鼠小腸顯微結構，從而影響小鼠生長，顯著減緩體質量增加。

（2）同濃度不同類型微塑料（PE和PS）對小鼠腸道結構與生長的影響沒有顯著差異。