李建秋，龔 冰，季 節(jié)，周子琛，仇 浩

近年來，土壤和地下水中砷（As）、硒（Se）污染已成為世界性難題。As是一種廣泛分布于環(huán)境中的類金屬元素，其在地殼中的豐度列于第二十位[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定，成人每日As攝入量上限為15 μg·kg-1[2]。隨著工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，含As礦的開采和冶煉，殺蟲劑、除草劑[3]的使用等人為來源產(chǎn)生的As大量進入自然界中，造成土壤和水環(huán)境中As含量的嚴重超標，對生態(tài)環(huán)境安全乃至人體健康產(chǎn)生潛在危害[4]。《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國土壤總超標率為16.1%，其中As點位超標率達到了2.7%，問題尤其突出，僅次于8大重金屬中的Cd（7.0%）和Ni（4.8%）[5-6]。與As不同，Se是人體和動物必需的微量元素[7]，具有重要的生物學(xué)功能，但其是否是高等植物的必需元素還沒有被證實。WHO規(guī)定，Se每日攝入量上限為400μg[2]。自然界中過量的Se會對土壤、大氣和水造成嚴重污染，給人體健康帶來很大的危害[8]。近年來，環(huán)境中Se污染現(xiàn)象越來越普遍[9-12]，因而受到廣泛關(guān)注。As和Se具有相似的化學(xué)性質(zhì)，因此多以混合物形式存在于土壤、植物以及水環(huán)境系統(tǒng)中，很多環(huán)境效應(yīng)無法用單一金屬的作用機理來解釋[13]。有研究表明Se可以減輕植物生長過程中的重金屬脅迫，增強植物的抗氧化能力[14]。例如營養(yǎng)液中添加Se能顯著降低As對水稻幼苗的毒害效應(yīng)，二者之間存在拮抗作用[15]。與此相反，一些研究者報道了As和Se通過抑制彼此的代謝物從而強化毒害效應(yīng)，二者之間存在協(xié)同作用[16-17]。As、Se之間矛盾的相互作用引起了人們的廣泛關(guān)注，因此，有必要深入開展As、Se復(fù)合毒理效應(yīng)研究，并構(gòu)建能準確評價含氧陰離子型金屬毒性和生態(tài)風(fēng)險的有效預(yù)測模型。

在分析和預(yù)測復(fù)合污染物毒性作用時，有兩個常用的加和參考模型（Reference model）：濃度加和（Concentration Addition，CA）和獨立作用（Independent Action，IA）模型[18]。CA模型假設(shè)混合物組分具有相同的作用機理或作用點位，IA模型則假設(shè)不同組分的作用機理或作用點位不同。如果混合物的觀測毒性與加和參考模型預(yù)測毒性一致，則認為該混合物無交互作用，或稱加和作用。如果觀測毒性明顯偏離加和參考模型預(yù)測毒性，則認為該混合物產(chǎn)生毒性交互作用，即拮抗（小于預(yù)測毒性）或協(xié)同作用（大于預(yù)測毒性）[19]。盡管這兩個參考模型被廣泛應(yīng)用在混合物毒性研究當(dāng)中，但均只適用于無交互作用的混合物，對于具有交互作用的混合物并不能定量預(yù)測其毒性，且無法被用來直接解讀混合物毒性作用機理[19-20]。實際環(huán)境混合物的各組分之間的交互作用復(fù)雜多樣，其聯(lián)合作用效應(yīng)不僅與組分種類有關(guān)[21]，也與組分濃度比及效應(yīng)水平有關(guān)。利用加和參考模型對水中有關(guān)銅、鎘、鋅的二元或三元復(fù)合污染毒性研究（160組數(shù)據(jù)）進行元分析發(fā)現(xiàn)，存在拮抗或協(xié)同作用的情形占80%左右[22]。如何進一步定量地評估混合物聯(lián)合毒性是亟待解決的關(guān)鍵問題，而明晰混合物交互作用的程度及機制并將其納入機理性的毒性預(yù)測模型中加以考慮則是準確評估混合物毒性的必要條件。

國內(nèi)外在加和參考模型預(yù)測結(jié)果的基礎(chǔ)上，嘗試通過對參考模型進行數(shù)學(xué)拓展或結(jié)合生物有效性分析來定量預(yù)測水環(huán)境體系中金屬混合物的聯(lián)合毒性[23-25]，并取得一定進展，整體上提高了模型的預(yù)測能力。生物配體模型（Biotic Ligand Model，BLM）整合了影響生物有效性的三大因素：濃度、絡(luò)合和競爭[26]。假設(shè)單一金屬毒性主要取決于溶液（土壤溶液）中自由金屬離子活度，而自由金屬離子活度受有機、無機配體絡(luò)合的影響；其他共存陽離子（如Ca2+、H+等）能夠和自由金屬離子競爭生物配體的結(jié)合位點從而緩解金屬的毒性[27]。由于該模型充分考慮了生物有效性的重要性，在預(yù)測和評價單一重金屬的水生或陸生毒性效應(yīng)方面得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用[28-30]。實踐中，競爭性共存陽離子可通過影響上述反應(yīng)過程而對單一金屬毒性產(chǎn)生影響。將這種競爭機制拓展到重金屬復(fù)合污染的情形下，考慮混合物組分在前述兩個反應(yīng)過程中的交互作用及主要影響因子，同時假定最終結(jié)合在生物配體上的各金屬的濃度加和代表有效致毒劑量，那么就可以改進并拓展BLM理論來預(yù)測混合物毒性，該設(shè)想在簡單水溶液體系和土壤體系中已得到初步驗證[29-30]，但該理論是否適用于含氧陰離子型金屬混合物的毒性預(yù)測尚缺乏研究。

本研究以小麥（Triticum aestivum L.）作為模式植物，溶液體系為毒性測試介質(zhì)，開展兩種典型陰離子型類金屬元素（As和Se）的室內(nèi)毒性暴露試驗，系統(tǒng)研究模式植物對含氧陰離子型類金屬單一及混合物的毒性響應(yīng)，闡明As、Se及其交互作用產(chǎn)生的毒性機制，探索構(gòu)建基于生物有效性的機理模型來預(yù)測As、Se及其混合物毒性效應(yīng)，以期為含氧陰離子型類金屬污染土壤風(fēng)險評估提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

供試小麥品種為NAU 9918，購買于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。小麥種子預(yù)發(fā)芽后選取根長度為1.0～1.5 cm的小麥幼苗進行植株毒性試驗。實驗設(shè)計如表1所示。

1.2 測試溶液

采用水培法研究As、Se及其二元混合物的毒性。營養(yǎng)液由0.2 mmol·L-1CaCl2和5 μmol·L-1H3BO3組成。通過添加不同含量的含氧陰離子型類金屬（Na2HAsO4·7H2O、Na2SeO3·5H2O，分析純試劑）至營養(yǎng)液中制備測試溶液。配制好不同濃度的測試溶液后，在小麥短期急性暴露實驗開始前24 h內(nèi)進行各測試溶液pH值的調(diào)節(jié)。利用0.75 g·L-1的MES緩沖溶液和0.01 mol·L-1的NaOH溶液將每組測試溶液的pH值調(diào)至6.0±0.1。

1.3 供試儀器

頂置光源人工氣候箱：浙江省寧波市新江南儀器有限公司，RXZ-1000F-4型；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，GZX-9140 MBE型；實驗室pH計：上海安萊立思儀器科技有限公司，pH510型；ICP-OES：上海賽默飛世爾科技有限公司，iCAP7600型；電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，SQP型。

1.4 毒性測試

參照ISO標準（11269-1）進行植物根伸長毒性試驗[31]。作為生物毒性（植物、微生物和動物）的一種手段，植物毒性試驗因操作簡便、試驗條件要求低而廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域，其作為生態(tài)風(fēng)險評估的常規(guī)方法已經(jīng)得到普遍認可[32-37]。根據(jù)實驗內(nèi)容，設(shè)計不同濃度的As、Se測試溶液，每個濃度設(shè)置2個平行，對照組設(shè)置4個平行，每個平行中有4株幼苗。實驗時，挑選根長一致的幼芽移植到裝有250 mL測試溶液的燒杯中。隨后將其移入培養(yǎng)箱中，在設(shè)定的暴露條件（溫度20℃，濕度75%，光照強度52 000 lx，16 h光照，8 h黑暗）下培養(yǎng)4 d。在實驗過程中，每日更新測試溶液，以降低植物生長對溶液pH和金屬濃度的潛在影響。暴露4 d后，將幼苗從燒杯中取出，記錄每株幼苗最長的根長值。計算相對根伸長（RRE，%），作為小麥暴露于As、Se及其二元混合物的毒性終點。

1.5 化學(xué)分析

在毒性測試前后分別測定每個處理組的pH值，pH平均值用于化學(xué)形態(tài)計算。采用ICP-OES對測試液的As、Se進行測定，每測20個樣品會加入1個5 mg·L-1的多元素標準試劑（MultiElement Calibration Std.#1，J&K Scientific Ltd.）和1個空白樣品進行質(zhì)量控制，As和Se的回收率均在90%以上。利用WHAMⅦ軟件計算As、Se的自由離子活度，輸入的模型參數(shù)包括As、Se濃度、測試溶液pH值、溫度、CO2分壓等。

1.6 數(shù)據(jù)分析與建模

1.6.1 劑量響應(yīng)曲線擬合

綜合每組小麥根伸長數(shù)據(jù)，得到平均相對根伸長與平均相對偏差，其中相對根伸長是實驗測量小麥根伸長與該組對照組小麥根伸長之比，公式為：

式中：LA表示暴露于測試溶液中的小麥根伸長，cm；LC表示對照組中小麥的根伸長，cm。

依據(jù)log-logistic公式[38]擬合，得到對應(yīng)的劑量-響應(yīng)曲線。

式中：Ci表示化合物i在體系中的濃度；溶解濃度表示為{M}diss，自由離子活度表示為{M}free；βi表示劑量響應(yīng)曲線的斜率；EC50為半數(shù)有效濃度，是指當(dāng)小麥根伸長達到50%抑制時對應(yīng)的濃度。在本實驗中，EC50值越大代表含氧陰離子型金屬在該條件下的毒性越小，反之則越大。

1.6.2 CA模型

在CA模型中，混合體系中的a、b組分都通過同一毒性作用模式產(chǎn)生毒性效應(yīng)，可表述為：

式中：xi表示化合物i在混合物體系中產(chǎn)生的毒性效應(yīng)；Ci表示化合物i在體系中的濃度；ECxi表示該化合物單獨作用并產(chǎn)生xi（%）毒性效應(yīng)時對應(yīng)的單組分濃度。

1.6.3 IA模型

與CA不同的是，IA模型假設(shè)混合體系內(nèi)的組分通過不同毒性作用模式產(chǎn)生毒性效應(yīng)。公式可描述為：

式中：RREi表示化合物i在單一暴露時產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

1.6.4 BLM模型

BLM將生物膜表面活性位點視為配位體（生物配體，BL），根據(jù)BLM理論[26]，金屬毒性強弱取決于其所結(jié)合的生物配體BL占所有配體的比例fMBL，結(jié)合其他競爭性陽離子（Ca2+、Mg2+、Na+、K+）與pH值的影響，可表述為：

式中：K表示條件結(jié)合常數(shù)；{Mn+}和{XZ+}分別表示金屬離子和競爭性陽離子的自由離子活度，mol·L-1。

當(dāng)金屬（M）產(chǎn)生50%毒性效應(yīng)時，公式（5）可改寫為：

式中：EC50{Mn+}為導(dǎo)致50%毒性效應(yīng)時金屬離子的活度；f50%MBL為導(dǎo)致50%毒性效應(yīng)時小麥根配體位點被金屬離子占據(jù)的比例。小麥根長可以表述為：

本研究中，考慮As-Se交互作用，將BLM應(yīng)用于As-Se聯(lián)合毒性的預(yù)測時，可將公式改寫為：

BLM模型所需參數(shù)，如條件結(jié)合常數(shù)K、βi和fM5B0L%等均使用Excel 2010軟件通過最優(yōu)化RRE和fMBL的關(guān)系估算得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一體系下As、Se脅迫對小麥的毒性

如圖1所示，As、Se單獨作用于小麥時，隨著As、Se濃度的增加，小麥根長逐漸減小，表明二者都具有毒性。通過Logistic模型對其劑量響應(yīng)曲線進行擬合，可求得As和Se的半數(shù)有效濃度（表2）。當(dāng)以溶解態(tài)濃度為劑量表達時，As和Se的EC50分別為3.03 μmol·L-1和45.35 μmol·L-1，當(dāng)以自由離子活度為劑量表達時，二者的EC50分別為2.88μmol·L-1和43.51 μmol·L-1，由劑量響應(yīng)曲線可知，無論以何種劑量表達形式，As的毒性都遠高于Se。從單一毒性測試中獲得的劑量響應(yīng)曲線參數(shù)將直接用于CA和IA模型預(yù)測As-Se二元混合物毒性。

圖1 單一體系中小麥相對根伸長與溶解態(tài)金屬濃度以及自由離子活度之間的劑量響應(yīng)關(guān)系Figure 1 Dose-response relationship between relative root elongation of Triticumaestivum and dissolve metal concentrations/freemetal ion activitiesin single As（a）and Se（b）exposuresystem

表2 As、Se劑量-響應(yīng)曲線擬合參數(shù)輸出Table 2 Summary of dose-response parameters（EC50 with standard errors are indicated in brackets，β）for Asand Se

2.2 As脅迫對小麥Se毒性的影響

不同濃度As脅迫對Se生物毒性的影響見圖2a和圖2b。通過比較兩圖可以發(fā)現(xiàn)，兩種劑量表達方法即溶解濃度和自由離子活度在毒性規(guī)律上區(qū)別不大，基本相似。當(dāng)Se濃度相同時，隨著環(huán)境中As濃度的增加（即，溶解濃度從0.40μmol·L-1增加到6.81 μmol·L-1；自由離子活度從0.38 μmol·L-1增加到6.45 μmol·L-1），小麥相對根伸長出現(xiàn)了明顯的降低趨勢，說明當(dāng)環(huán)境中Se濃度不變時，As濃度的增加會對小麥產(chǎn)生明顯的毒害作用，導(dǎo)致小麥受到As-Se的聯(lián)合毒性作用。

2.3 Se脅迫對小麥As毒性的影響

不同濃度Se脅迫對As生物毒性的影響見圖2c和圖2d。通過比較兩圖可以發(fā)現(xiàn)，兩種劑量表達方法即溶解濃度和自由離子活度在毒性規(guī)律上有所區(qū)別。由劑量響應(yīng)曲線可知，當(dāng)As濃度較低時（即，溶解濃度小于2.27μmol·L-1；自由離子活度小于2.16 μmol·L-1），隨著Se濃度的增加（即，溶解濃度從4.94 μmol·L-1增加到 72.95 μmol·L-1；自由離子活度從4.74 μmol·L-1增加到69.97 μmol·L-1），小麥相對根伸長有明顯減小的趨勢，說明低濃度As條件下，Se濃度的增加，顯著加強了其毒性作用。但隨著As濃度的增加，這種趨勢越來越小，說明高濃度As條件下，Se濃度的增加對其毒性的影響較小。

在As-Se二元混合物中，不論以何種劑量表達形式，一種陰離子金屬的存在都會影響另一種陰離子金屬的植物毒性（圖2）。

2.4 CA/IA模型預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性

圖3通過采用溶解濃度和自由離子活度劑量兩種表達形式來比較CA和IA模型所預(yù)測的效應(yīng)值（相對根伸長值）與實際觀測值的差異，從而確定交互作用類型，見表3。結(jié)果顯示，在CA/IA模型中，無論是基于何種劑量表達形式，模型預(yù)測值整體上都小于實際觀測值。這表明簡單的CA/IA模型高估了含氧陰離子型金屬二元混合物對陸地植物小麥的毒性。在CA/IA模型中，當(dāng)相對根伸長的模型預(yù)測值與實際觀測值的比值小于1時，說明二元混合污染物之間存在拮抗作用；若相對根伸長的模型預(yù)測值與實際觀測值的比值大于1，則說明二元混合污染物之間存在協(xié)同作用。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，As-Se之間的拮抗作用很明顯。當(dāng)相對根伸長較長時，即As-Se濃度較低時，As-Se之間只存在拮抗作用；隨著As-Se濃度和毒性的增加，在關(guān)系圖的中間部位出現(xiàn)了輕微的加和作用；當(dāng)As-Se濃度繼續(xù)增加時，As-Se之間還是表現(xiàn)為拮抗作用。整體來看，As-Se之間的聯(lián)合毒性還是以拮抗作用為主。Se對As的拮抗效應(yīng)已被大量報道，陳海珍等[39]認為As與Se結(jié)構(gòu)相似，因而具有相似的吸收機制，二者存在競爭關(guān)系，因此Se能緩解As的毒害作用。As-Se之間存在著復(fù)雜的相互作用，有研究指出Se拮抗As對水稻的毒害作用是由于二者之間較強的化學(xué)親和力形成了某種穩(wěn)定且低毒的As-Se復(fù)合物，而非Se的存在降低水稻根際對As的吸收量[40]。此外，Se具有較強的抗氧化能力可緩解As污染毒害對植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶的抑制作用，從而降低了植物體內(nèi)As的毒性效應(yīng)[40]。

圖2 不同Se（As）濃度下，As（Se）濃度與小麥相對根伸長之間的劑量響應(yīng)關(guān)系Figure 2 Dose-response relationship between the dissolved concentration（a，c）/free ion activity（b，d）and relative root elongation of Triticumaestivum in As-Se mixture

表3 CA/IA模型預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性Table 3 Performances of CA/IA for quantifying toxicities of As-Se to wheat roots

2.5 BLM模型預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性

CA/IA模型在預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性時，其預(yù)測值整體上都小于觀測值，兩種模型都高估了聯(lián)合毒性，表明As-Se間存在交互作用，主要表現(xiàn)為拮抗作用。對于具有交互作用的混合物CA/IA模型并不能定量預(yù)測其毒性，且無法被用來直接解讀混合物毒性作用機理，因此進一步嘗試使用充分考慮了生物有效性的BLM模型解釋As-Se交互作用并預(yù)測聯(lián)合毒性，考慮了混合物交互作用的BLM模型更能反映混合物毒性的實際情況，在實際環(huán)境中更具有參考價值和現(xiàn)實意義。將單一As、Se以及As-Se混合的毒性數(shù)據(jù)一起進行BLM模型擬合，使用Excel 2010軟件中的規(guī)劃求解功能通過獲得最小化均方根誤差（RMSE）來最優(yōu)化RRE和fMBL的關(guān)系，從而估算As、Se的結(jié)合常數(shù)K、f50%MBL和βM等模型參數(shù)，見表4。

由圖4可知，使用BLM模型對As-Se聯(lián)合脅迫下小麥根長毒性效應(yīng)進行的預(yù)測能力效果很好（R2=0.90），這表明所構(gòu)建的BLM模型實現(xiàn)了對含氧陰離子型二元金屬混合物聯(lián)合毒性的準確預(yù)測，解釋了超過90%的毒性變化。在BLM模型中，考慮到As-Se外部競爭作用導(dǎo)致的生物有效性的變化，所有數(shù)據(jù)點都集中在1∶1線附近，反映出這種拮抗作用主要發(fā)生在生物體外部，As-Se整體上呈現(xiàn)濃度加和（無拮抗或協(xié)同作用）的趨勢，有力地證明了陰離子型金屬采用BLM模型是進行環(huán)境質(zhì)量風(fēng)險評估的有效方式。

3 結(jié)論

（1）不論以何種劑量表達形式（溶解濃度和自由離子活度劑量），一種陰離子金屬的存在都會影響另一種陰離子金屬的植物毒性。

圖3 CA/IA模型預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性效應(yīng)與實際觀測值的對比Figure 3 The mixed effects were predicted using the reference models（CA and IA）based on the dissolved metal concentration（a）and free ion activity（b）

表4 BLM模型預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性參數(shù)Table 4 Summary of model fitsassociated with the BLM to As-Se toxicities to wheat roots

（2）根據(jù)獲得的As、Se單一毒性數(shù)據(jù)，利用不同劑量表達耦合加和參考模型（CA/IA）預(yù)測混合物毒性時，無論是基于何種劑量表達形式，模型預(yù)測值整體上都小于實際觀測值，表明加和參考模型高估了As-Se二元混合物對陸生植物小麥的毒性，因此判定As-Se之間呈明顯拮抗作用。

（3）將As-Se外部競爭作用納入BLM模型后，實現(xiàn)了對陰離子型類金屬As-Se聯(lián)合毒性的準確預(yù)測，由于該模型充分考慮了生物有效性的重要性，更能反映As-Se混合毒性的真實情況，在實際環(huán)境中更具參考價值和現(xiàn)實意義。

圖4 BLM模型預(yù)測As-Se聯(lián)合毒性效應(yīng)與實際觀測值的對比Figure 4 The observed versus predicted relative root elongation of Triticum aestivum exposed to As-Semixture for 4 days based on the BLM