余光銀 陶麗麗 殷曉敏 陳耀麗 王柳

肝纖維化是一種常見的病理狀態(tài),其中肝星狀細(xì)胞(HSC)被激活,然后細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白積聚,通常與由感染、藥物、代謝紊亂或自身免疫失衡引起的慢性肝病相關(guān)。肝纖維化如果控制不好,將導(dǎo)致不可逆的肝硬化,甚至是肝細(xì)胞癌［1,2］。到目前為止,除了去除潛在的病因或肝移植外,還沒(méi)有有效的臨床療法來(lái)抑制肝纖維化的病理進(jìn)展。除此之外,研究人員過(guò)分關(guān)注抑制肝星狀細(xì)胞的活化,而不是保護(hù)肝臟的功能。畢竟,持續(xù)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡對(duì)于引發(fā)瘢痕形成至關(guān)重要［3,4］。因此,需要研究肝纖維化的分子基礎(chǔ),并開發(fā)一種保護(hù)實(shí)質(zhì)細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新治療方法。自噬是一種關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)途徑,破壞的細(xì)胞器和受損蛋白質(zhì)被降解,為真核細(xì)胞中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)提供能量。自噬途徑通過(guò)保守的基因產(chǎn)物的幾個(gè)階段進(jìn)行。在誘導(dǎo)(營(yíng)養(yǎng)物剝奪或饑餓)后,雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)的抑制激活ULK1/ 2-Atg13-Atg101-FIP200 復(fù)合物(Atgs,自噬相關(guān)基因),其啟動(dòng)分離膜或形成噬菌體。自噬的啟動(dòng)還伴隨著Vps34-Vps15(p150)-Beclin1 復(fù)合物的激活。刺激Beclin1 復(fù)合物產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P),其促進(jìn)自噬體膜成核。自噬體延伸需要Atg5-Atg12 和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3/酵母自噬相關(guān)基因8(LC3/ Atg8)綴合系統(tǒng)［5,6］。此外,LC3 參與選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)自噬底物蛋白62(p62)/ SQSTM1 和NBR1 等蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)含有特殊的LC3 相互作用區(qū)域基序,用作細(xì)胞結(jié)構(gòu)隔離的適配器,如線粒體,蛋白質(zhì)聚集體和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)。GTP 酶Ras 相關(guān)蛋白7(Rab7)需要完成與溶酶體融合的自噬體階段。在最后階段,溶酶體酸水解酶降解自噬體內(nèi)容物,并釋放自溶酶體的內(nèi)容物用于代謝回收。自噬在調(diào)節(jié)脂肪形成中起關(guān)鍵作用,與脂肪變性和肝纖維化有關(guān)。它可以通過(guò)脂質(zhì)減少脂滴。否則,長(zhǎng)期脂質(zhì)負(fù)荷可能在體外和體內(nèi)改變膜脂組成并減少自噬體和溶酶體的融合［7］。因此,在肝臟中過(guò)量脂質(zhì)抑制自噬可能導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂滴積聚。然而,據(jù)報(bào)道,活化的自噬通過(guò)降解脂滴為肝星狀細(xì)胞的活化和增殖提供能量。自噬通過(guò)降解膠原蛋白來(lái)抑制纖維化。自噬的激活降解小鼠肝臟中的Ⅰ型膠原蛋白,減少氧化應(yīng)激,并抑制炎癥以抑制纖維化。它還可以保護(hù)肝細(xì)胞免受凋亡。因此,自噬在肝星狀細(xì)胞活化和從脂肪變性到纖維化的過(guò)程中的作用是有爭(zhēng)議的。

1 資料與方法

1.1 方法 在饑餓模型中,在對(duì)照組(禁食)中,對(duì)15 只7 周齡小鼠進(jìn)行4 h 禁食,1 h 再喂養(yǎng)的模式,之后立即處死。在實(shí)驗(yàn)組(肝纖維化)中,對(duì)15 只小鼠注射1 ml/kg 的50%CCl4橄欖油2 次/周,持續(xù)8 周,對(duì)照組注射相同劑量的橄欖油8 周。對(duì)于肝纖維化和禁食模型中,注射CCl4或橄欖油,將處理過(guò)的大鼠禁食1 h。之后收集肝組織和血清進(jìn)行分析。在饑餓期間,這些動(dòng)物可以獲得飲用水。使用三唑試劑從細(xì)胞顆?；蛐迈r組織中提取總核糖核酸。如前所述,通過(guò)MTT 分析評(píng)估細(xì)胞活力。經(jīng)過(guò)不同的處理(DMSO 或0.05%CCl4)和不同的培養(yǎng)時(shí)間(0、24、48、72 h),在測(cè)試波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)為570、630 nm 的掃描孔微培養(yǎng)板讀取器中讀取孔的吸光度。HepG2細(xì)胞在4℃下用10%甲醛固定30 min,用BODIPY493/503 染色15 min。用磷酸緩沖液(PBS)洗滌后,細(xì)胞核用DAPI 染色20 min。熒光顯微鏡檢測(cè)脂滴和自噬體,進(jìn)行圖像采集和圖像分析。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 第6 版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值標(biāo)準(zhǔn)劃分,兩組以上數(shù)據(jù)比較進(jìn)行單向方差和事后多重分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

自噬相關(guān)基因的表達(dá),包括LC3(Atg8 的哺乳動(dòng)物同源物)、酵母自噬相關(guān)基因6(Atg6)、酵母自噬相關(guān)基因5(Atg5)和p62/SQSTM1,在蛋白質(zhì)和基因水平上均與SVIP 過(guò)度表達(dá)呈正相關(guān)(見圖a,b)。與對(duì)照組相比,它們?cè)赟VIP 細(xì)胞中的表達(dá)減少(見圖e,f)。為了評(píng)估自噬通量,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ通過(guò)巴非霉素A1 計(jì)算,巴非霉素A1 中和溶酶體的酸堿度并阻斷自噬體-溶酶體融合(見圖c,d)。轉(zhuǎn)錄因子EB 的表達(dá)由于SVIP 過(guò)度表達(dá)而以劑量依賴的方式增加(見圖c,d),這解釋了SVIP 在轉(zhuǎn)錄水平上增加自噬相關(guān)基因(Atgs)和p62 的表達(dá)(見圖b,f)。以上所有證據(jù)表明SVIP 促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的自噬。

饑餓可以在體外和體內(nèi)激活自噬。此外,SVIP 增強(qiáng)了饑餓誘導(dǎo)的自噬。但是,饑餓是否會(huì)增加肝臟或肝癌細(xì)胞中的SVIP 表達(dá)仍然未知。盡管LC3、p62、Beclin1 和Atg5 的表達(dá)因營(yíng)養(yǎng)缺乏而顯著改變,但SVIP 表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞的饑餓不敏感,也不在肝臟中,在肝臟組織中禁食24、48 h 后,SVIP 仍然是不可檢測(cè)的(見圖g,h,i)。同樣,SVIP 表達(dá)不受小鼠大腦饑餓的影響(見圖j)。

大鼠接受CCl4處理分別注射3、5、8 周。在肝纖維化的發(fā)展過(guò)程中,大鼠肝臟的病理特征發(fā)生了顯著變化。最初,膠原纖維的區(qū)域和脂肪變性區(qū)域被觀察到。纖維化大鼠肝臟顯示不同程度的損傷：輕度,中等,嚴(yán)重,對(duì)應(yīng)于3、5、8 周CCl4分別治療。圖表顯示,倒V 形曲線以及脂滴的大小。在中度纖維化大鼠肝臟中達(dá)到頂點(diǎn)(見圖k,l,m,n)。此外,采用抗形狀記憶合金α 的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)生化分析測(cè)定肝功能損傷和肝纖維化的嚴(yán)重程度分別證實(shí)了進(jìn)展中的肝纖維化,此外,分析相關(guān)基因產(chǎn)物的表達(dá),蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)評(píng)估自噬。SVIP 和LC3 的表達(dá)在第5 周比第3 周增加,然后在第8 周下降(見圖o)。最后,SVIP 和基因水平在第3～8 周也呈倒V 型曲線。在CCl4期間治療自噬活性在5 周達(dá)到頂峰,然后在8 周下降。這些數(shù)據(jù)表明,SVIP 的表達(dá)與自噬活性以及纖維化大鼠肝臟中脂滴的大小密切相關(guān)。

圖a

圖b

圖c

圖d

圖e

圖f

圖g

圖h

圖i

圖j

圖k

圖l

圖m

圖n

圖o

3 討論

SVIP 保護(hù)肝細(xì)胞的機(jī)制可能包括減少脂肪變性肝臟中脂肪酸的積累和增強(qiáng)抗氧化作用。最初,研究表明肝細(xì)胞由于CCl4刺激導(dǎo)致脂肪酸的積累和脂質(zhì)過(guò)氧化引起了細(xì)胞毒性。因此,SVIP 可以調(diào)節(jié)自噬,減少脂質(zhì)的積累［8,9］。此外,SVIP 有一個(gè)含纈酪肽蛋白(VCP)相互作用基序,而泛素連接酶羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶降解蛋白1(Hrd1)和STUB1/CHIP 依賴它們的VCP 結(jié)合基序降解底物。相互作用基序和結(jié)合基序都能與VCP 脫氫酶第一亞單位(ND1)結(jié)構(gòu)域結(jié)合,ND1 與相互作用基序的親和力高于VBM25。因此,SVIP 的增加競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了Hrd1 和STUB1/CHIP 與VCP 的結(jié)合,并減少了它們的底物降解。Nrf2 和TFEB,Hrd1 和STUB1/CHIP 的底物,是調(diào)節(jié)與抗氧化應(yīng)激和溶酶體生物發(fā)生相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄因子［10-12］。SVIP 的表達(dá)在CCl4大鼠肝臟和肝癌細(xì)胞中增多。該機(jī)制可能與泛素-蛋白酶體途徑的激活有關(guān)。一些研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加了SVIP,激活了泛素蛋白酶體途徑。當(dāng)CCl4導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解和SVIP 表達(dá)增加。自噬被SVIP 激活以保護(hù)肝細(xì)胞。如果SVIP被耗盡,自噬被抑制。同時(shí),HepG2細(xì)胞對(duì)CCl4毒性更敏感。自噬與肝脂肪變性和纖維化密切相關(guān)［13-15］。然而,從脂肪變性到纖維化過(guò)程中的自噬動(dòng)力學(xué)鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明自噬隨著肝脂肪變性的發(fā)展而激活,然后一旦發(fā)展成纖維化就失活。這里,在CCl4中的治療模型,激活自噬或SVIP 表達(dá)可減輕肝纖維化。隨著激活的自噬,脂滴的體積不斷增加,而在肝癌細(xì)胞中SVIP 過(guò)度表達(dá)或饑餓也顯示出增大的脂滴。

綜上所述,SVIP 的表達(dá)與CCl4形成過(guò)程中的自噬水平密切相關(guān),且誘導(dǎo)肝纖維化。SVIP 能誘導(dǎo)自噬和延緩肝纖維化。研究SVIP 激活自噬的分子機(jī)制具有十分重要的意義,為今后抗纖維化提供了新的理論依據(jù)。