孫建， 周紅英， 樂美旺， 顏廷獻(xiàn)， 饒月亮， 顏小文， 梁俊超， 葉艷英

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，江西省油料作物生物學(xué)重點實驗室，國家油料改良中心南昌分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，南昌 330200)

芝麻(SesamumindicumL.)是重要優(yōu)質(zhì)油料作物，種子含油量高，不飽和脂肪酸占85%左右，富含芝麻素(sesamin)、芝麻林素(sesamolin)、維生素E等天然抗氧化類物質(zhì)[1-3]，是重要的優(yōu)質(zhì)食用油源和營養(yǎng)保健食品[4-5]。萌發(fā)生理是種子生物學(xué)的重要內(nèi)容之一，在很多植物中開展了大量相關(guān)研究，包括種子萌發(fā)的逆境生理、營養(yǎng)及化學(xué)成分變化和代謝生理等方面。關(guān)于芝麻種子萌發(fā)過程的相關(guān)研究多集中在營養(yǎng)及化學(xué)成分[6-7]、芽苗生長與生理[8-9]等方面，關(guān)于代謝生理方面的報道不多，韓亞飛等[10]在30 ℃條件下對芝麻種子萌發(fā)0～48 h的總糖、粗脂肪、粗蛋白和氨基酸組成等變化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示,總糖含量先降后升，粗脂肪含量逐漸下降，粗蛋白含量變化不明顯，不同類型氨基酸占比變化不同。張瑞等[11]研究了35 ℃暗培養(yǎng)條件下芝麻種子萌發(fā) 0～72 h 的粗脂肪、粗蛋白、總糖和脂肪酸組成等的變化，結(jié)果顯示，粗脂肪含量在36 h后降低幅度較大，粗蛋白含量變化較小，總糖含量不斷增加，脂肪酸組成之間變化幅度較小。張麗霞等[12]研究了芝麻種子在28 ℃條件下萌發(fā)0～96 h的脂肪酸組成、氨基酸組成、粗脂肪、粗蛋白等主要成分的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)粗脂肪含量在萌發(fā)的36 h以前變化較小，粗蛋白含量則呈現(xiàn)先降后升再降的變化，84 h后下降明顯，主要脂肪酸組分的變化不大，17種氨基酸變化各不相同，酸性氨基酸占比隨著種子萌發(fā)不斷增加，中性和堿性氨基酸不斷減少。這些研究主要針對芝麻種子萌發(fā)過程的營養(yǎng)成分變化，尚未從代謝生理的角度對芝麻種子主要貯藏物質(zhì)參與代謝的先后順序進(jìn)行研究。因此，本研究擬檢測芝麻萌發(fā)動態(tài)的形態(tài)學(xué)和水分需求變化，確定芝麻種子萌發(fā)的關(guān)鍵時間點，并進(jìn)一步測定芝麻種子萌發(fā)過程中與代謝相關(guān)的可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸、游離脂肪酸及脂肪酶等生理指標(biāo)變化，明確種子主要貯藏物質(zhì)參與代謝的先后順序，在萌發(fā)動態(tài)和代謝生理上豐富芝麻種子生物學(xué)相關(guān)內(nèi)容，并為芝麻種子萌發(fā)代謝機理的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為贛芝9號和贛芝12號，其中贛芝9號為黑芝麻品種，粗脂肪含量為50.5%，粗蛋白含量為19.7%；贛芝12號為白芝麻品種，粗脂肪含量57.1%，粗蛋白含量20.6%。種子均由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所芝麻創(chuàng)新團(tuán)隊提供，選取正常成熟、籽粒飽滿的芝麻種子備用。

1.2 試驗設(shè)計

試驗分兩步開展，均在黑暗狀態(tài)的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。第一步用于觀察芝麻種子萌發(fā)動態(tài)，測定吸水率、吸水速率、粗脂肪含量和脂肪酸組成，將精選的干凈種子放置在鋪有3層濾紙的發(fā)芽盤中，每盤稱取10 g平鋪于濾紙上，確保種子籽粒之間不重疊，每盤等量地加入充足的蒸餾水以供萌發(fā)，分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、36、42、48、54、60、66和72 h取樣，每個時間點取樣3盤，即3次重復(fù)。每個樣品取出后測定鮮重，并于60 ℃烘箱烘干至恒重，稱量干重用于粗脂肪、脂肪酸組成的測定。根據(jù)第一步的發(fā)芽動態(tài)、吸水率和吸水速率測定結(jié)果，確定0、6、12、24、48、72 h共6個時間點進(jìn)行第二步試驗，將精選的干凈種子放置在鋪有3層濾紙的發(fā)芽盒中，發(fā)芽盒長11 cm、寬11 cm、高6 cm，每盒放置種子200粒，同樣于25 ℃暗培養(yǎng)，每個時間點取樣3盒，即3次重復(fù)，將取樣樣品用蒸餾水沖洗干凈并用濾紙吸干水分備用，用于測定可溶性糖含量等生理指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

吸水率為種子吸收水分的質(zhì)量占種子干重的百分比，吸水速率為每g干種子每h吸收的水分質(zhì)量。粗脂肪含量采取索氏抽提法(GB/T 14772-2008)[11]測定，采取氣相色譜法[11]測定棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸4個主要脂肪酸組成成分。可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13]測定，氨基酸含量采用水合茚三酮法[13]測定?？扇苄缘鞍缀坎捎肂CA法[14]測定。脂肪酶活性通過銅皂-分光光度法測定脂肪酸生成速率并進(jìn)行計算[15]。游離脂肪酸含量采取銅皂比色法[16]測定。所用試劑均購自蘇州科銘生物技術(shù)公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Microsoft Excel 2007和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、相關(guān)性分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)動態(tài)及其水分變化

芝麻種子萌發(fā)動態(tài)見圖1，可見，25 ℃暗培養(yǎng)情況下，12 h芝麻種子實現(xiàn)萌動露白，24 h進(jìn)入胚根快速伸長階段，48 h胚根和胚芽同步快速伸長生長，72 h子葉開始展開完成種子萌發(fā)過程，繼而進(jìn)入芽期幼苗生長階段。

圖1 芝麻種子萌發(fā)過程的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Germination morphology of sesame seed

芝麻種子萌發(fā)過程的吸水率和吸水速率結(jié)果(圖2)顯示，種子吸水率呈先急速上升后平穩(wěn)增加接著再次快速上升的規(guī)律，呈現(xiàn)兩個快速吸水期，贛芝9號和贛芝12號3 h吸水率分別達(dá)到50.77%和44.19%，并在6 h后進(jìn)入較為平穩(wěn)增加階段，24～54 h，吸水率開始進(jìn)入第二次快速上升階段，贛芝9號和贛芝12號分別迅速增加到162.55%和153.92%，接著增速有所減緩。吸水速率的變化呈現(xiàn)出由高吸水速率(贛芝9號和贛芝12號分別為169.23和147.12 mg·h-1·g-1)快速下降，9 h降到最低，隨后開始平穩(wěn)上升，至 54 h 達(dá)到第二個峰值(贛芝9號和贛芝12號分別為51.51和45.79 mg·h-1·g-1)，然后再次下降。兩個品種萌發(fā)過程中的吸水率和吸水速率的變化趨勢表現(xiàn)一致，但也存在較小差異，這可能與品種的種皮結(jié)構(gòu)、物質(zhì)組成和萌發(fā)特點等差異有關(guān)。

結(jié)合種子萌發(fā)形態(tài)和種子吸水率、吸水速率結(jié)果，可以確定25 ℃暗培養(yǎng)條件下，芝麻種子于浸水6 h時吸收的水分超過自身干重，基本滿足對水分的需求，達(dá)到種子萌發(fā)階段的“吸脹”，此前吸水率急劇上升，吸水速率最高。12 h進(jìn)入種子萌發(fā)的第二階段“萌動”，即“露白”，對水分的需求趨于平穩(wěn)，吸水率增加較慢，吸水速率在較低水平變化。隨后在24 h開始進(jìn)入胚根伸長時期， 48 h后胚根和胚芽的下胚軸開始同步進(jìn)入快速伸長生長時期，對水分的需求開始快速增加。72 h 時子葉基本展開，完成了種子萌發(fā)的第三階段“發(fā)芽”，隨后進(jìn)入幼苗生長階段。

鑒于此，本研究下一步開展的代謝生理研究將圍繞干種子(0 h)、吸脹(6 h)、萌動(12 h)、胚根開始伸長(24 h)、胚芽的下胚軸開始伸長(48 h)和基本完成萌發(fā)(72 h)共6個時間點進(jìn)行。

2.2 種子萌發(fā)過程的可溶性糖含量變化

可溶性糖是芝麻種子貯藏的主要碳水化合物之一，也是種子萌發(fā)過程中脂肪代謝的最終產(chǎn)物之一。圖3顯示，芝麻干種子中貯藏有一定量的可溶性糖，吸脹(6 h)時可溶性糖含量急劇下降，差異達(dá)顯著水平。隨著萌發(fā)過程的推進(jìn)，可溶性糖含量呈先降后升的變化趨勢，品種間變化趨勢基本一致。種子吸脹(6 h)到胚芽下胚軸開始伸長生長(48 h)，可溶性糖被不斷消耗，含量不斷降低，在完成發(fā)芽(72 h)時含量又有所增加，差異達(dá)到顯著水平。

注：不同小寫字母表示同一品種不同萌發(fā)時間的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different lowercase letters of the same variety indicate significant difference between different germination times at P<0.05 level.圖3 芝麻種子萌發(fā)過程的可溶性糖含量變化Fig.3 Changes of soluble sugar content during germination of sesame seed

2.3 種子萌發(fā)過程的蛋白質(zhì)代謝

蛋白可溶化是貯藏蛋白進(jìn)入代謝過程的第一步。2個供試品種種子萌發(fā)過程中，可溶性蛋白含量均呈先降后升的變化規(guī)律(圖4)，吸脹(6 h)時可溶性蛋白含量較干種子顯著下降，然后隨著種子的萌發(fā)進(jìn)程，可溶性蛋白含量不斷升高，6～72 h不同萌發(fā)時間的可溶性蛋白含量差異均達(dá)到顯著水平。

注：不同小寫字母表示同一品種不同萌發(fā)時間的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different lowercase letters of the same variety indicate significant difference between different germination times at P<0.05 level.圖4 芝麻種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白含量和氨基酸含量的變化Fig.4 Changes of soluble protein content and amino acid content during germination of sesame seed

作為蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，氨基酸是參與生命活動的重要因子。芝麻種子萌發(fā)過程中，氨基酸含量呈現(xiàn)不斷下降趨勢(圖4)，同一品種不同萌發(fā)時間的氨基酸含量差異均達(dá)到顯著水平。供試品種間的變化趨勢基本一致，但品種間的含量存在較大差異，贛芝12號的氨基酸含量明顯高于相同萌發(fā)時間的贛芝9號。

2.4 種子萌發(fā)過程的脂肪代謝

萌發(fā)過程中種子粗脂肪含量結(jié)果(圖5)顯示，從干種子(0 h)、吸脹(6 h)、萌動(12 h)到胚根伸長(24 h)，種子的粗脂肪含量沒有顯著變化。胚芽伸長(48 h)后，粗脂肪含量開始顯著下降。在種子萌發(fā)過程中，游離脂肪酸含量表現(xiàn)為先急劇下降后不斷升高再快速下降的趨勢。在干種子(0 h)中存在一定含量的游離脂肪酸，在種子吸脹(6 h)時游離脂肪酸急劇下降到最低水平，其后隨著種子萌發(fā)進(jìn)程的推進(jìn)，游離脂肪酸含量不斷上升，在胚芽伸長(48 h)時達(dá)到最高值，然后在發(fā)芽(72 h)時再次快速下降。脂肪酶活性結(jié)果(圖5)顯示，種子萌發(fā)過程中脂肪酶活性不斷增加，品種間總體變化趨勢基本一致，但品種間存在差異。在吸脹(6 h)和萌動(12 h)時兩個供試品種間基本沒有差異，胚根伸長(24 h)后，贛芝12號的脂肪酶活性大幅度增加，而贛芝9號的脂肪酶活性增加較緩，這可能與品種的粗脂肪含量有關(guān)，高含油量的贛芝12號較低含油量的贛芝9號在種子萌發(fā)的脂肪代謝中需要更高活性的脂肪酶。

注：不同小寫字母表示同一品種不同萌發(fā)時間的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different lowercase letters of the same variety indicate significant difference between different germination times at P<0.05 level.圖5 芝麻種子萌發(fā)過程中粗脂肪含量、游離脂肪酸含量和脂肪酶活性的變化Fig.5 Changes of crude fat content, free fatty acid content and lipase activity during germination of sesame

對種子萌發(fā)過程中的主要脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果(圖6)顯示，棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸4種主要脂肪酸組成基本保持穩(wěn)定，變化較小，這與前人的研究結(jié)果[11-12]一致。棕櫚酸在種子發(fā)芽(72 h)時有所降低，但降低幅度較小，分別為1.56%(贛芝9號)和1.94%(贛芝12號)。相關(guān)性分析顯示，油酸與亞油酸之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.522，P<0.01)。

圖6 芝麻種子萌發(fā)過程的主要脂肪酸組成變化Fig.6 Changes of main fatty acid composition during germination of sesame seed

2.5 相關(guān)分析

對芝麻種子萌發(fā)過程中與代謝相關(guān)的可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸、粗脂肪、游離脂肪酸和脂肪酶活性共6個生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果(表1)顯示，可溶性糖含量與脂肪酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，粗脂肪含量與氨基酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，脂肪酶活性與可溶性蛋白呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。蛋白質(zhì)代謝中，可溶性蛋白含量與氨基酸含量呈負(fù)相關(guān)，與蛋白質(zhì)代謝生成氨基酸有關(guān)。脂肪代謝中，脂肪酶活性與游離脂肪酸含量呈正相關(guān)，與粗脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，粗脂肪含量與游離脂肪酸含量正相關(guān)，但三者相互間的相關(guān)系數(shù)均較小，可能與芝麻種子萌發(fā)0～72 h內(nèi)脂肪代謝量較低有關(guān)。

表1 芝麻種子萌發(fā)過程代謝生理指標(biāo)的相關(guān)分析Table 1 Correlation analysis of physiological indexes of metabolism during germination of sesame seed

3 討論

種子萌發(fā)是植物重要的生命過程之一，可以分為吸脹、萌動、發(fā)芽和成苗4個階段，涉及一系列的生理和形態(tài)變化，并受環(huán)境條件的影響[17]。本研究在25 ℃暗培養(yǎng)條件下，通過形態(tài)學(xué)、水分吸收和代謝生理指標(biāo)的檢測，明確了芝麻種子吸脹、萌動、胚根快速伸長、胚芽快速生長和完成發(fā)芽的時間點，并對芝麻種子的萌發(fā)低謝機理進(jìn)一步研究。芝麻種子吸脹時間的確定為芝麻生產(chǎn)中浸種處理提供理論參考，即25 ℃時浸種時間不宜超過6 h，溫度較高時可適當(dāng)縮減浸種時間[10-11]。

碳水化合物(糖)、蛋白質(zhì)和脂肪是芝麻種子中的主要物質(zhì)成分，占種子質(zhì)量的90%以上[18]，也是參與芝麻種子萌發(fā)代謝的主要物質(zhì)。芝麻種子中糖類主要是葡萄糖、果糖、蔗糖、車前糖等可溶性糖[18-19]。種子萌發(fā)過程中，可溶性糖中的葡萄糖等直接被代謝利用，蔗糖等則被快速分解為小分子物質(zhì)被利用，為種子萌發(fā)和胚生長提供能量[17,20]。本研究中芝麻萌發(fā)過程中，可溶性糖含量在0～48 h之間不斷減少，在完成發(fā)芽的72 h時則表現(xiàn)為增加，這與韓亞飛等[10]的研究一致，也與其他脂肪類種子的研究結(jié)果[20-21]相同。種子萌發(fā)72 h時，可溶性糖含量增高，可能是脂肪代謝產(chǎn)生糖類的原因[17]。因此，糖類是芝麻種子萌發(fā)過程中最先被代謝利用的物質(zhì)，為萌發(fā)和生長提供能量，而脂肪代謝明顯遲于糖代謝。

蛋白質(zhì)在種子萌發(fā)過程中具有不可替代的作用，其代謝產(chǎn)物氨基酸參與新蛋白合成或為呼吸氧化提供碳架[17,22-23]。種子中的蛋白質(zhì)主要以貯藏蛋白形式存在，其參與代謝的第一步是轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白。本研究中芝麻種子萌發(fā)過程中，吸脹(6 h)時可溶性蛋白較干種子有所降低，隨后隨著萌發(fā)進(jìn)程的推進(jìn)不斷上升，變化趨勢與花生[24]和刺萼龍葵[25]等的研究結(jié)果相似?？赡苁欠N子吸脹引起細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致可溶性蛋白透過膜外滲，從而表現(xiàn)為可溶性蛋白含量降低，隨后貯藏蛋白不斷實現(xiàn)水溶化，導(dǎo)致可溶性蛋白含量增加[20]。

作為種子中高能量貯藏物，脂肪在酶的作用下分解出的脂肪酸轉(zhuǎn)化為糖供植物利用[20]。本研究結(jié)果顯示，芝麻種子萌發(fā)過程中粗脂肪含量在24 h前基本沒有變化，48 h后才開始不斷下降。游離脂肪酸含量在吸脹(6 h)時大幅度下降，這可能與吸脹引起的細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致的游離脂肪酸外滲有關(guān)[17,20]，隨后不斷上升，于48 h達(dá)到最高值后再次下降。隨后脂肪分解，游離脂肪酸含量不斷上升，在48 h之后游離脂肪酸進(jìn)入代謝過程，其含量再次下降。綜合來看，粗脂肪含量24 h之后開始減少，游離脂肪酸含量48 h達(dá)到高峰后快速降低，脂肪酶活性不斷增強，以及可溶性糖含量于72 h再次升高，可以認(rèn)為芝麻種子萌發(fā)過程中脂肪的代謝發(fā)生較晚。

綜上所述，在芝麻種子萌發(fā)過程中，糖類物質(zhì)最先參與代謝，其后是蛋白質(zhì)，最后才是脂肪，這與其他油料作物種子萌發(fā)代謝順序基本一致[17,20]。本研究結(jié)果闡述了芝麻種子萌發(fā)過程中物質(zhì)代謝先后順序，為萌發(fā)過程中相關(guān)基因表達(dá)及代謝組學(xué)等進(jìn)一步研究提供了理論參考。