尹勇剛, 袁軍偉, 劉長(zhǎng)江, 韓斌, 李敏敏, 孫艷,賈楠, 郭紫娟, 趙勝建

(河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所, 河北 秦皇島 066000)

葡萄是世界上栽培面積最廣的果樹之一。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，2017年世界葡萄種植面積達(dá)693.14萬hm2，年產(chǎn)量7 427.66萬t；中國(guó)葡萄栽培總面積達(dá)77.86萬hm2，產(chǎn)量1 316.08萬t[1]。我國(guó)西北地區(qū)與渤海灣區(qū)因其極為適宜的氣候條件，成為我國(guó)優(yōu)質(zhì)葡萄的重要產(chǎn)區(qū)，而該地區(qū)日趨加劇的鹽漬化也嚴(yán)重制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，具有耐鹽性的砧木可提高葡萄嫁接組合的整體耐鹽能力[4-5]，不同葡萄砧木品種的耐鹽差異因其對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)機(jī)制不同所致[6]。研究葡萄砧木在鹽脅迫下生理變化規(guī)律是探索葡萄抵抗鹽害的重要方式，對(duì)避免葡萄生產(chǎn)遭遇潛在的鹽漬傷害具有重要意義。

鹽堿等生態(tài)脅迫極易影響植物光合作用[7]。鹽脅迫通常導(dǎo)致植物葉片光合效率下降[8]，研究表明，輕度鹽脅迫主要因滲透脅迫引起氣孔限制所致[9-10]，而中高度鹽脅迫下光合受阻主要為非氣孔限制[11-12]。然而，這種最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)停滯乃至死亡的非氣孔限制因素及其在不同鹽濃度脅迫下的主次作用尚不明確。

二氧化碳作為原料與吸收轉(zhuǎn)化光能的葉綠素是對(duì)光合反應(yīng)產(chǎn)生直接影響的兩個(gè)重要因素。位于類囊體中的光反應(yīng)中心是光合原初反應(yīng)的場(chǎng)所，是光合反應(yīng)順利進(jìn)行的保障。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可實(shí)時(shí)反映光合結(jié)構(gòu)狀態(tài)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于監(jiān)測(cè)非生物脅迫下果樹[13]、蔬菜[14]及作物[15]等多種植物的受害程度。本研究圍繞光合反應(yīng)3個(gè)重要指標(biāo)——葉綠素含量、光合氣體交換和葉綠素?zé)晒鈪?shù),對(duì)鹽脅迫下的兩種典型葡萄砧木品種進(jìn)行對(duì)比分析，研究不同鹽濃度下葡萄抵抗脅迫的方式和主次轉(zhuǎn)化，為耐鹽葡萄砧木在鹽害多發(fā)區(qū)的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

基于本課題組前期對(duì)21份葡萄砧木耐鹽性鑒定結(jié)果[16]，本研究以具有典型特征的耐鹽性品種101-14M(V.riparia×V.rupestris)和鹽敏感品種188-08(V.berlandieri×V.riparia)作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年4—7月在河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所創(chuàng)新基地進(jìn)行。4月初將1年生砧木苗種植于裝有培養(yǎng)基質(zhì)(蛭石：珍珠巖=3∶1)的大營(yíng)養(yǎng)缽中，營(yíng)養(yǎng)缽上口徑13.5 cm，下口徑9.5 cm，高22.0 cm，底部留孔，于避雨棚內(nèi)進(jìn)行常規(guī)管理。當(dāng)砧木苗長(zhǎng)到8～10片葉時(shí)，選取生長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的苗木，用于NaCl脅迫處理。

每天分別用濃度為4、6、8和10 g·kg-1的NaCl溶液對(duì)2種砧木品種進(jìn)行定量(每株0.8 L)灌溉，以同樣量的清水灌溉為對(duì)照(CK)。每個(gè)品種各設(shè)5個(gè)處理，每處理10株，3次重復(fù)。鹽脅迫處理28 d后，測(cè)定光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并從每株相同位置采6～8片葉用于測(cè)定葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1葉綠素含量測(cè)定 參照Arnon[17]的方法，將采集回來的新鮮葉片剪碎混勻，稱取0.2 g，于φ=80%丙酮溶液中暗處浸提12 h。用UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)分別于663和646 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光值。

1.3.2光合氣體交換參數(shù)測(cè)定 選取苗木上部第6～8片功能葉，采用LI-6400XT便攜式光合儀(美國(guó)LI-COR公司)于晴天9:00—11:00測(cè)定光合氣體交換參數(shù)：葉片凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)和蒸騰速率(transpiration rate，Tr)。測(cè)定控制光強(qiáng)為1 600 μmol·m-2·s-1，CO2體積分?jǐn)?shù)為360 μL·L-1，相對(duì)濕度為70%。

1.3.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 利用PAM-2500便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(德國(guó)Walz公司)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。葉片暗適應(yīng)30 min后執(zhí)行飽和脈沖，測(cè)定初始熒光產(chǎn)量(minimal fluorescence，F(xiàn)0)及最大熒光產(chǎn)量(maximal fluorescence，F(xiàn)m)；自然光照40 min后執(zhí)行飽和脈沖，測(cè)量光下初始熒光(F0′)、光下最大熒光(Fm′)和穩(wěn)態(tài)熒光(fluorescence in stable state，F(xiàn)a)，并計(jì)算以下參數(shù)。

可變熒光(variable fluorescence，F(xiàn)v)=Fm-F0

光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ complex，PSⅡ)最大光化學(xué)效率=Fv/Fm

PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率Yield=(Fm′-Fa)/Fm′

光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical quenching，qP)=(Fm′-Fa)/(Fm′-F0)

非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching，NPQ)=Fm/Fm′-1

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖表制作；使用SPSS 20.0軟件以Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下2種葡萄砧木葉片葉綠素含量變化

圖1顯示，鹽害發(fā)生后，2種葡萄砧木的葉綠素a與葉綠素b含量均呈現(xiàn)先升后降的走勢(shì)。NaCl濃度為6 g·kg-1時(shí)，188-08的葉綠素a含量開始下降，低于CK 14.70%；在8 g·kg-1的鹽濃度下，101-14M的葉綠素a含量開始顯著下降，相比CK下降8.50%。隨NaCl濃度升高，188-08葉片葉綠素a含量降低幅度明顯大于101-14M。101-14M葉片葉綠素b含量顯著高于188-08，但兩者間差異隨NaCl濃度升高逐漸縮小?？梢?，在較高濃度NaCl脅迫下，維持較高的葉綠素含量，尤其是葉綠素a的含量，是保證葡萄砧木耐鹽能力的關(guān)鍵因素。

2.2 NaCl脅迫下2種葡萄砧木葉片光合氣體交換參數(shù)變化

凈光合速率(Pn)是光合系統(tǒng)功能的直接體現(xiàn)，也是檢驗(yàn)植株光合系統(tǒng)工作正常與否的指標(biāo)。從圖2可以看出，隨NaCl濃度升高，2種葡萄砧木的Pn顯著降低。在4、6、8、10 g·kg-1的鹽脅迫下，101-14M的Pn相比于CK分別降低了6.99%、27.12%、49.66%、60.88%;188-08的Pn相比于CK則分別降低了43.01%、52.29%、64.93%、68.66%，下降幅度顯著高于101-14M。188-08在NaCl濃度為4 g·kg-1時(shí)Pn出現(xiàn)顯著下降，在8 g·kg-1時(shí)下降幅度相對(duì)放緩；101-14M葉片Pn亦隨NaCl濃度升高而逐步下降，但均顯著高于188-08。

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖1 NaCl脅迫下兩葡萄砧木葉片葉綠素含量變化Fig.1 Effect of salt stress on chlorophyll content in leaves of two rootstocks

在4、6、8、10 g·kg-1的NaCl脅迫下，101-14M氣孔導(dǎo)度(Gs)明顯下降，與CK相比，依次降低了31.66%、53.83%、74.67%、86.81%；188-08的Gs則分別降低了63.29%、70.63%、81.12%、82.17%，在4 g·kg-1的NaCl處理下降幅最大，隨后放緩，在8與10 g·kg-1NaCl處理間無顯著差異。CK處理下，101-14M的Gs明顯高于188-08，直至NaCl濃度達(dá)到10 g·kg-1前，101-14的Gs均保持高于188-08。

胞間二氧化碳濃度(Ci)是分析光合速率降低原因的指標(biāo)之一。圖2顯示，NaCl脅迫處理中，188-08和101-14M的Ci均顯著下降，前者相比CK在各鹽濃度處理下分別降低了26.88%、32.30%、40.73%、56.75%，后者則分別降低了37.80%、55.95%、58.04%、56.18%。隨NaCl濃度的升高，101-14M的Ci逐漸下降，而188-08的Ci則在6 g·kg-1NaCl處理下趨于穩(wěn)定。不同鹽濃度脅迫下。101-14M葉片Ci始終高于188-08。

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖2 NaCl脅迫下2種葡萄砧木葉片光合氣體交換參數(shù)變化Fig.2 Photosynthetic gas exchange parameters changes in leaves of two grape rootstocks under NaCl stress

NaCl脅迫處理后，2種葡萄砧木葉片的蒸騰速率(Tr)顯著下降。101-14M和188-08在不同濃度NaCl處理下，Tr均顯著低于CK。在4～6 g·kg-1NaCl處理中，2種砧木的Tr較為穩(wěn)定；NaCl濃度達(dá)到8 g·kg-1時(shí)，2種砧木品種Tr繼續(xù)下降。不同濃度NaCl脅迫下，101-14M始終保持著高于188-08的蒸騰速率。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到10 g·kg-1時(shí)，101-14M和188-08的Tr僅為各自CK的15.08%和9.80%。蒸騰作用最主要的方式是氣孔蒸騰，Tr降低主要與Gs有關(guān)。

2.3 NaCl脅迫下2種葡萄砧木葉片熒光參數(shù)變化

F0為充分暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)的初始熒光強(qiáng)度，是PSⅡ處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量，代表不參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分。如圖3所示，鹽脅迫發(fā)生后，2種砧木葉片F(xiàn)0先升高后降低。6 g·kg-1NaCl脅迫下，188-08開始降低；NaCl濃度為8 g·kg-1時(shí)，101-14M的F0顯著降低。F0與葉綠素含量顯著相關(guān)，也與光合機(jī)構(gòu)關(guān)閉程度有關(guān)，光合受阻與葉綠素含量增加均會(huì)導(dǎo)致F0升高。

暗適應(yīng)下的最大熒光產(chǎn)量Fm是PSⅡ完全關(guān)閉狀態(tài)下的熒光產(chǎn)量，反映通過PSⅡ的電子傳遞情況。圖3顯示，隨NaCl濃度升高，F(xiàn)m呈下降趨勢(shì)。NaCl濃度達(dá)到4 g·kg-1時(shí)，2種砧木品種與各自對(duì)照無顯著差異，隨后下降。結(jié)果表明，NaCl在4 g·kg-1時(shí)，PSⅡ電子傳遞受外界影響較??；達(dá)到6 g·kg-1時(shí)，PSⅡ電子傳遞開始受阻，并隨鹽濃度升高，電子傳遞受阻程度逐漸增大。相同濃度NaCl處理下，101-14M顯示出高于188-08的電子傳遞效率。

從圖3可以看出，2種葡萄砧木品種CK中的PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm、實(shí)際光化學(xué)效率Yield值無顯著差異。NaCl處理中，2種葡萄砧木Fv/Fm、Yield和qP均隨著NaCl處理濃度升高而下降，188-08降幅明顯，同濃度NaCl處理下低于或顯著低于101-14M。2種葡萄砧木CK中Fv/Fm(0.76±0.004 5，0.76±0.004 0)處于活體葉片正常范圍內(nèi)，188-08與101-14M葉片F(xiàn)v/Fm分別在4和6 g·kg-1的 NaCl處理下，出現(xiàn)顯著下降。188-08Yield值下降速度大于101-14M，表明其PSⅡ反應(yīng)中心更易受到損傷，關(guān)閉程度更大。qP是由光合作用引起的熒光淬滅，可反映植物光合活性的高低。2種葡萄砧木葉片qP隨著鹽濃度升高而逐漸穩(wěn)定下降，101-14M的qP顯著高于188-08，NaCl濃度達(dá)到10 g·kg-1時(shí)，101-14M與188-08的qP分別為各自CK的68.8%和48.2%。

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖3 NaCl脅迫下2種葡萄砧木葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig.3 Chlorophyll fluorescence parameters changes in leaves of two grape rootstocks under NaCl stress

非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ是由熱耗散引起的熒光淬滅，反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，即光保護(hù)能力。圖3顯示，2種葡萄砧木的NPQ隨NaCl濃度升高而呈先升后降趨勢(shì)。101-14M 的NPQ先小幅上升，表明光合作用在減弱，使得一部分能量以熱量形式耗散，在10 g·kg-1NaCl處理下小幅下降，略高于對(duì)照；188-08變化幅度大于101-14M，表明其光合受抑制程度更高，其NPQ在NaCl濃度為8 g·kg-1時(shí)開始降低，在10 g·kg-1NaCl處理下顯著低于CK。NPQ增加通常伴隨F0升高，PSⅡ失活是兩者升高的原因之一。

3 討論

2種葡萄砧木在NaCl脅迫發(fā)生時(shí)，各生理參數(shù)變化趨勢(shì)相似，但對(duì)鹽濃度改變時(shí)的反應(yīng)存在差異。植株根部細(xì)胞遭受NaCl脅迫使水分向地上部分運(yùn)輸受到阻礙，保衛(wèi)細(xì)胞失水導(dǎo)致氣孔逐漸閉合，氣孔導(dǎo)度Gs下降，這與鹽脅迫下其他植物變化趨勢(shì)相同[18]。隨Gs降低，188-08的Ci在6～10 g·kg-1的NaCl下保持平穩(wěn)，表明光合過程對(duì)CO2的利用率下降，導(dǎo)致光合受阻的已不是氣孔限制[19]；101-14M的Ci則持續(xù)下降，表明CO2同化用量多于吸入CO2量，氣孔限制仍是導(dǎo)致其光合下降的原因之一。

伴隨細(xì)胞失水，鹽離子進(jìn)入細(xì)胞，抑制葉綠素前體的合成，中等濃度NaCl促進(jìn)葉綠素降解[20]。葉綠素通過接收傳遞和轉(zhuǎn)化光能為光合作用提供能量，葉綠素的減少會(huì)直接降低光合產(chǎn)量。本研究中葉綠素含量在較低NaCl濃度下升高，與李學(xué)孚等[21]對(duì)‘鄞紅’葡萄研究結(jié)論不同，或與水培法栽植及更長(zhǎng)的鹽脅迫時(shí)長(zhǎng)有關(guān)。葉綠素含量在低濃度NaCl脅迫下之所以升高或許有以下2個(gè)原因：根細(xì)胞通過調(diào)節(jié)膜透性限制Na+[22]或Cl-[23]進(jìn)入細(xì)胞，使葉綠素合成及葉綠素酶降解未受到NaCl明顯的影響；氣孔限制引起光合受阻使得對(duì)葉綠素利用率降低，導(dǎo)致葉綠素累積。在對(duì)大豆[24]、棉花[25]和向日葵[26]的相關(guān)研究中也得出相似結(jié)論。隨NaCl濃度升高，2種砧木葉綠素含量先后下降，表明葉綠素合成遭到鹽離子較大程度的破壞，葉綠素含量減少進(jìn)一步限制了188-08的光合作用。這或許亦是8 g·kg-1NaCl脅迫下101-14M葉片光合下降的主要原因之一，在對(duì)鹽脅迫下黃瑞香[27]、蘿卜[28]和荊芥[29]等植物的研究中亦有相同結(jié)論。

與此同時(shí)，NaCl脅迫導(dǎo)致Fm、Fv/Fm、Yield和qP降低，表明PSⅡ活性在鹽害發(fā)生后即遭受抑制，這與Athar等[30]對(duì)油菜的研究結(jié)果一致；同時(shí)可以看到，在中低濃度NaCl處理中，部分參數(shù)(如4 g·kg-1NaCl下的Fm)相比對(duì)照變化不顯著，說明植物體對(duì)鹽脅迫產(chǎn)生了一定的抵抗，這種抵抗能力在101-14M中表現(xiàn)更為明顯。Yield下降幅度高于Fv/Fm，也表明鹽害發(fā)生時(shí)就引發(fā)了光抑制[31]。F0在鹽脅迫發(fā)生后升高，升高幅度也反映了光反應(yīng)活性受抑制程度，隨NaCl濃度升高，188-08和101-14M的F0先后降低，或因接收轉(zhuǎn)化光能的葉綠素合成受阻導(dǎo)致，F(xiàn)0與葉綠素含量顯著相關(guān)。鹽脅迫使葡萄砧木葉片熒光淬滅系數(shù)qP下降，是光化學(xué)反應(yīng)效率降低的明顯特征，這與張玲等[32]對(duì)辣椒的研究結(jié)果類似。同時(shí)過剩的能量以熱耗散形式輻射，導(dǎo)致NPQ升高，NPQ隨后在高鹽濃度下降低，或因葉綠素含量下降致使光能轉(zhuǎn)化率降低所致，同時(shí)PSⅡ受損傷亦使光能利用率下降[33]。

總之，鹽脅迫下101-14M各生理指標(biāo)相比188-08變化幅度更小，在高濃度NaCl下仍有相對(duì)較高的光合產(chǎn)出。本研究對(duì)前人所述的非氣孔限制因素開展了進(jìn)一步研究，認(rèn)為非氣孔限制主要為葉綠素和PSⅡ限制，不同NaCl濃度脅迫引起光合受阻的主要限制因素不同。鹽濃度為6 g·kg-1時(shí)，188-08光合速率降低主要是由氣孔限制轉(zhuǎn)向葉綠素限制，在8 g·kg-1NaCl脅迫下，PSⅡ受到嚴(yán)重?fù)p傷；而101-14M葉片在8 g·kg-1鹽脅迫下，主要受到葉綠素限制；在10 g·kg-1鹽脅迫下，其PSⅡ反應(yīng)中心遭遇損傷。表明101-14M可忍耐8～10 g·kg-1的NaCl脅迫。同時(shí)，通過長(zhǎng)時(shí)鹽脅迫，對(duì)葡萄砧木的耐鹽能力相對(duì)量化，為更好地選擇利用耐鹽砧木品種提供數(shù)據(jù)支持。