張艷麗, 任柳, 張宇宏, 張偉

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京100081；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院, 南昌330047；3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOX,EC 1.1.3.4)是一種需氧脫氫酶，可在有氧條件下專一性地將β-D-葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過氧化氫[1-2]。GOX能夠除氧、產(chǎn)酸、殺菌、去除葡萄糖，在食品加工、醫(yī)療診斷、飼料添加劑、化工等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用[3-6]。黑曲霉和青霉等真菌是GOX的主要生產(chǎn)菌株[7-8]，動(dòng)植物體內(nèi)GOX含量很低且提取受限[9]。昆蟲GOX在與植物互作中起著非常重要的作用[10]。Musser等[11-12]發(fā)現(xiàn)GOX可以抑制煙草中昆蟲取食所誘導(dǎo)的煙堿含量，還能調(diào)控番茄中胰蛋白酶抑制素的表達(dá)水平[13]，對(duì)植物葉表面的昆蟲病原體起到抗菌抑制作用[14]。

棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)是我國(guó)主要的廣食性農(nóng)業(yè)害蟲，主要危害棉花、煙草、番茄、小麥和玉米等農(nóng)作物[15]。Eichenseer等[16]研究表明，美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)唾液中的主要成分GOX能夠抑制煙草葉片煙堿對(duì)其的誘導(dǎo)作用，其催化反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2和葡萄糖酸也有相同的作用。Hu等[17]研究表明，葡萄糖可以誘導(dǎo)棉鈴蟲下唇腺GOX活性的升高。棉鈴蟲GOX具有較大的應(yīng)用潛力，為了更深入研究其特性以及實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)，需要獲得大量GOX蛋白，但來源于昆蟲的GOX含量較低且提取極其困難，因此,通過微生物細(xì)胞工廠異源高效表達(dá)棉鈴蟲GOX蛋白具有重要的意義。

畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是一種常用于異源蛋白生產(chǎn)的微生物細(xì)胞工廠，其具有甲醇誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1，遺傳背景清楚，適合高密度發(fā)酵，能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。近年來已有研究者使用P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)對(duì)絲狀真菌來源的GOX成功進(jìn)行了異源表達(dá)，但棉鈴蟲來源GOX的異源表達(dá)尚未見報(bào)道。本研究首次成功在畢赤酵母中異源表達(dá)了棉鈴蟲來源的GOX，并對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，為棉鈴蟲GOX作用機(jī)理解析和實(shí)際應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，也為開發(fā)利用其它昆蟲來源的GOX提供了范例。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1棉鈴蟲、菌株與質(zhì)粒 2齡期棉鈴蟲及人工飼料購自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所生物農(nóng)藥中試基地科云生物農(nóng)藥技術(shù)研發(fā)中心；畢赤酵母GS115菌株和pPICZαA質(zhì)粒為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；畢赤酵母GS115H菌株為GS115的衍生菌株，包含his4基因，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；大腸桿菌E.coliTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2試劑與儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒5×All-In-One RT MasterMix，加拿大ABM公司；PCR相關(guān)試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、PmeⅠ)、TRIzol試劑、Zeocin和T4連接酶，美國(guó)Thermo公司；內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H(Endo-H)，New England Biolabs公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技有限公司；辣根過氧化物酶和鄰聯(lián)茴香胺，Ameresco公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

立式高速離心機(jī)，日本HITACHI公司；PCR儀和基因電轉(zhuǎn)儀，Bio-Rad公司；UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司； AKTA purifier和HiTrap CaptoQ，美國(guó)GE Healthcare公司。

1.1.3培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化用LB培養(yǎng)基。酵母培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基，酵母轉(zhuǎn)化以及酶蛋白的誘導(dǎo)產(chǎn)生用YPDZ、BMGY及BMMY等培養(yǎng)基，重組葡萄糖氧化酶轉(zhuǎn)化子篩選用MM平板顯色培養(yǎng)基[20]。

①YPDZ培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、酵母提取物10 g·L-1、瓊脂糖17 g·L-1，自然pH，115 ℃高壓滅菌30 min；待溫度下降至60℃以下，加入Zeocin抗生素(Zeocin濃度為300 μg·mL-1)。

②10×酵母無氨基氮源(YNB)：134 g·L-1YNB，0.22 μm濾膜過濾滅菌。

③500×生物素：0.2 g·L-1生物素，0.22 μm濾膜過濾滅菌。

④PTM1微量鹽：0.6% CuSO4、0.008% NaI2、0.3% MnSO4、0.02% Na2MoO4、0.002% H3BO4、0.05% CoCl2、2% ZnCl2、6.5% FeSO4、0.5% H2SO4(體積分?jǐn)?shù))。

⑤酵母發(fā)酵鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：0.5% KH2PO4、5% NH4H2PO4、1.485% MgSO4·7H2O、1.82% K2SO4、0.093% CaSO4、0.15% KOH，1×生物素、0.44% PTM1微量鹽、2%甘油(體積分?jǐn)?shù))。

⑥酵母發(fā)酵鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：0.5% KH2PO4、5% NH4H2PO4、1.485% MgSO4·7H2O、1.82% K2SO4、0.093% CaSO4、0.15% KOH，1×生物素、0.44% PTM1微量鹽，1%甲醇(體積分?jǐn)?shù))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1棉鈴蟲葡萄糖氧化酶基因hagox克隆

2齡期棉鈴蟲使用人工飼料(含或不含1%葡萄糖)喂養(yǎng)，每3 d為一個(gè)齡期，分別收集4齡期、5齡期、6齡期和蛾期的各10條棉鈴蟲，用液氮研磨，加入TRIzol試劑提取RNA。以棉鈴蟲各齡期的RNA為模板，用5×All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得棉鈴蟲各齡期的cDNA第一鏈。

參考NCBI數(shù)據(jù)庫中棉鈴蟲葡萄糖氧化酶基因(GenBank登錄號(hào)EU629216)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物HaGOX-F(5’-CCGGAATTCATGATTCTGGCG-CAGCAAGATTG-3’)和HaGOX-R(5’-TTGCGG-CCGCCTATTGCCAGGTCTGTTTG-3’)(下劃線部分分別為EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn))。以棉鈴蟲各齡期cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL、dNTPs 1.6 μL、FastPfu 0.5 μL、上下游引物各2.5 μL、cDNA 0.5 μL、超純水32.4 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2重組表達(dá)載體pPICZαA/HaGOX的構(gòu)建及基因序列分析 使用EcoRⅠ、NotⅠ將PCR回收產(chǎn)物和pPICZαA載體酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，T4 DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA/HaGOX，轉(zhuǎn)化E.coliTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，用具有Zeocin抗性的LB平板篩選，獲得含有棉鈴蟲葡萄糖氧化酶基因hagox的重組大腸桿菌。對(duì)重組大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Nucleotide Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比對(duì)。收集研究較多的真菌和昆蟲來源的葡萄糖氧化酶和本研究克隆得到的棉鈴蟲葡萄糖氧化酶氨基酸序列，使用MEGA6軟件Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用VectorNTI軟件預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)和分子量，使用SignalIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)預(yù)測(cè)O-糖基化位點(diǎn)。

1.2.3重組表達(dá)載體pPICZαA/HaGOX轉(zhuǎn)化酵母及誘導(dǎo)表達(dá) 從重組大腸桿菌中提取質(zhì)粒pPICZαA/HaGOX，經(jīng)PmeI酶切線性化后用異丙醇沉淀回收。取8 μg線性化的pPICZαA/HaGOX質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115H菌株，涂布YPDZ(Zeocin濃度300 μg·mL-1)固體平板，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。挑取轉(zhuǎn)化子于YPD及MM固體平板上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)36 h，MM平板用于顯色篩選陽性轉(zhuǎn)化子，YPD平板用于保存菌株。

通過BMGY/BMMY方法高通量篩選得到酶活力較高的轉(zhuǎn)化子：挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有500 μL BMGY培養(yǎng)基的48孔平板中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)36 h；4 000 r·min-1常溫離心10 min后棄除培養(yǎng)基，菌體用500 μL BMMY培養(yǎng)基重懸，28 ℃、200 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，每隔24 h按1%添加量補(bǔ)加甲醇；誘導(dǎo)結(jié)束后，4 000 r·min-1常溫離心10 min，收集上清酶液測(cè)定葡萄糖氧化酶活力。

酶活力較高的多個(gè)轉(zhuǎn)化子通過搖瓶培養(yǎng)進(jìn)一步篩選：挑取轉(zhuǎn)化子接種于含有10 mL BMGY培養(yǎng)基的40 mL離心管中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)36 h；6 000 r·min-1常溫離心5 min收集菌體，用5 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，28 ℃、200 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，每隔24 h按1%添加量補(bǔ)加甲醇；誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃、6 000 r·min-1離心5 min，收集上清酶液測(cè)定葡萄糖氧化酶活力。

將酶活力最高的轉(zhuǎn)化子用發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得粗酶液：將活化好的陽性菌株菌液按1%接種量接種于200 mL YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)36 h；離心收集菌體，用200 mL酵母發(fā)酵鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸菌體，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h；4 ℃、6 000 r·min-1離心5 min，離心收集菌體，用50 mL酵母發(fā)酵鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，28 ℃、200 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，每隔12 h補(bǔ)加終濃度為0.5%的甲醇；誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集上清即為粗酶液，用于后期分析。

1.2.4重組HaGOX蛋白的純化 HaGOX粗酶液使用10 kD超濾膜包進(jìn)行脫鹽和濃縮，所得超濾濃縮液使用陰離子交換層析法進(jìn)行純化。緩沖液分別為：A液20 mmol·L-1的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)；B液20 mmol·L-1的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)中加入終濃度為0.5 mol·L-1的NaCl。用25 mL的A液平衡CaptoQ(5 mL)層析柱，加入粗酶液，然后用B液進(jìn)行梯度洗脫：先用25 mL的10%B液洗脫雜蛋白，再用20%的B液洗脫目的蛋白，收集20% B液洗脫組分即為純化后的酶液。純化的HaGOX蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.5酶蛋白濃度測(cè)定 采用Bradford法(Bio-Rad)測(cè)定蛋白濃度：以牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，配置BSA母液10 mg·mL-1，稀釋到0.05～0.5 mg·mL-1。取不同濃度的的BSA溶液40 μL于酶標(biāo)板中，加入5倍稀釋的蛋白染液160 μL混勻，靜置30 min后利用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo)，BSA濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取純化后的HaGOX酶液40 μL，加入5倍稀釋的蛋白染液160 μL混勻，靜置30 min后測(cè)定595 nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品蛋白濃度。

1.2.6葡萄糖氧化酶活力的測(cè)定 在反應(yīng)管中加入2.5 mL鄰聯(lián)茴香胺緩沖液(0.1 mL的1%鄰聯(lián)茴香胺甲醇儲(chǔ)存液加入到12 mL的pH 6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中配制而成)，0.3 mL的18%葡萄糖溶液，0.1 mL辣根過氧化物酶溶液(濃度90 U·mL-1)，30 ℃保溫2 min后，加入葡萄糖氧化酶溶液0.1 mL，反應(yīng)3 min后，加入2 mL的2 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)量540 nm處的吸光值。葡萄糖氧化酶活力單位(U)定義為30 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘催化1 μmoL β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫所需的酶量。比活力定義為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力數(shù)，U·mg-1。

1.2.7重組HaGOX酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定 配制不同 pH 的緩沖液：Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 8.5、9.0、9.5)。用不同pH的緩沖液配制鄰聯(lián)茴香胺緩沖溶液，按照前述方法測(cè)定HaGOX樣品酶活力，每個(gè)樣品測(cè)定三個(gè)平行，相對(duì)酶活力最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)緩沖液的pH即為重組HaGOX的最適反應(yīng)pH。將HaGOX酶樣品置于不同pH的緩沖液中，37 ℃保溫1 h，然后在最適pH反應(yīng)體系中測(cè)定殘余酶活力，以不經(jīng)pH緩沖液處理的酶的活力設(shè)為100%，繪制酶的pH穩(wěn)定性曲線。

HaGOX酶分別在30、35、40、45、50、55、60 ℃下反應(yīng)測(cè)定酶活力，相對(duì)酶活力最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度即為HaGOX的最適反應(yīng)溫度。將HaGOX酶在45 ℃下分別保溫15、30、45、60 min，50 ℃下分別保溫5、10、15、30、45、60 min，55 ℃下分別保溫5、10、15 min，然后測(cè)定熱處理后樣品的殘余酶活力，以不經(jīng)熱處理的酶的活力設(shè)為100%，繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線。

在酶促反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子(Zn2+、Li+、Mn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+、Co2+、Ni2+)、金屬離子螯合劑EDTA、CTAB和SDS，終濃度為1 mmol·L-1或5 mmol·L-1。以未加上述化學(xué)試劑測(cè)得的酶活力計(jì)為100%。

配制0.1 mol·L-1的D-葡萄糖、6-脫氧-葡萄糖、2-脫氧-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、L-鼠李糖、α-乳糖、蔗糖、D-山梨糖、D-纖維二糖，將其分別作為底物測(cè)定酶活力，以D-葡萄糖作為底物所測(cè)定的酶活力計(jì)為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組HaGOX酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及hagox基因分析

以HaGOX-F/HaGOX-R為引物，5齡期和蛾期的cDNA為模板，均擴(kuò)增到了約2.0 kb的DNA片段。PCR產(chǎn)物連接pPICZαA獲得了重組載體pPICZαA/HaGOX。

測(cè)序結(jié)果顯示，hagox基因序列全長(zhǎng)1 821 bp，預(yù)測(cè)可編碼606個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子。SignalIP 4.1預(yù)測(cè)HaGOX重組蛋白無信號(hào)肽，VectorNTI軟件預(yù)測(cè)該蛋白等電點(diǎn)為pH 4.78，分子量大小66.9 kD。NetOGlyc 4.0 Server預(yù)測(cè)該蛋白有3個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)(195 S，205 T和408 S)。Blast比對(duì)顯示其DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的Helicoverpaarmigera來源的葡萄糖氧化酶基因(GenBank登錄號(hào)EU629216)相似性達(dá)97.75%，氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)ACC94296.1)相似性達(dá)99.67%(圖1)。

圖1 真菌和昆蟲部分GOX系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the GOX from fungus and insects

2.2 重組葡萄糖氧化酶HaGOX的表達(dá)分析

線性化pPICZαA/HaGOX重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115H菌株后，轉(zhuǎn)化子在MM培養(yǎng)基上顯色(圖2)，結(jié)果表明，HaGOX在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。經(jīng)高通量篩選及搖瓶水平篩選得到酶活最高轉(zhuǎn)化子，然后用發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)得到粗酶液，經(jīng)濃縮后用陰離子交換柱純化得到HaGOX純蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，目的蛋白條帶在70 kD左右，理論大小應(yīng)為66.9 kD，可能是由于糖基化導(dǎo)致。經(jīng)Endo H處理，得到的蛋白條帶與理論大小相符(圖3)，比活力為13.63 U·mg-1，可以進(jìn)行后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的分析。

注：“C”為空白對(duì)照GS115H菌株。Note：“C”in the plate is GS115H as control.圖2 平板顯色篩選陽性重組子Fig.2 Screening positive recombinants by coloring plate

注：M—蛋白分子量Marker；1—HaGOX粗酶液；2—HaGOX純化蛋白；3—Endo H糖基化處理后的HaGOX純化蛋白；4—Endo H。Note: M—Protein molecular mass markers; 1—Crude enzyme of HaGOX; 2—Purified HaGOX protein; 3—HaGOX deglycosylated by Endo-H; 4—Endo-H.圖3 HaGOX蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of the HaGOX

2.3 HaGOX酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1溫度和pH對(duì)酶活的影響 酶的反應(yīng)速率與溫度呈指數(shù)相關(guān)，溫度每升高10 ℃，酶反應(yīng)速度就會(huì)加倍。大多數(shù)酶在40～70 ℃溫度范圍內(nèi)會(huì)因高溫變性而失活，酶只有在最適溫度下才能發(fā)揮出最大的活性。重組HaGOX的最適溫度為40 ℃，當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力下降迅速，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，該酶完全失活(圖4A)。分別在45、50、55 ℃下測(cè)定其熱穩(wěn)定性，45 ℃處理1 h后酶活力殘留率高于60%，50 ℃下處理10 min后酶活力殘留率為40%左右，處理1 h后酶活力殘留率低于10%，而55 ℃處理10 min后酶活力完全喪失(圖4B)。

酶活性取決于活性位點(diǎn)中氨基酸的電離狀態(tài)，因此pH在維持酶蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。HaGOX的最適pH為6.0～7.0，在pH 5.0～7.5之間酶活力能夠保持在80%以上(圖4C)。37 ℃、不同pH條件下處理酶液1 h得到pH穩(wěn)定性曲線，HaGOX在pH5.0～8.5之間基本穩(wěn)定，酶活力保持在80%以上，經(jīng)pH 4.0處理后酶活力完全喪失，經(jīng)pH 9.0處理后酶活力仍能保持在70%以上(圖4D)。

A：HaGOX最適溫度；B：HaGOX溫度穩(wěn)定性；C：HaGOX最適pH；D：HaGOX pH穩(wěn)定性。A: Optimal temperature of HaGOX; B: Thermo stability of HaGOX;C: Optimal pH of HaGOX; D: pH stability of HaGOX.圖4 溫度和pH對(duì)HaGOX活力的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on the HaGOX activity

2.3.2金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)HaGOX酶活力的影響 研究了不同濃度下各金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)HaGOX酶活力的影響，從圖5可以看出，1 mmol·L-1CTAB存在下酶活力殘留約82%，5 mmol·L-1CTAB存在下酶活力殘留率降至60%；1 mmol·L-1SDS存在下酶活力喪失一半，而5 mmol·L-1SDS存在下HaGOX酶活力基本完全喪失。CTAB和SDS對(duì)HaGOX重組酶的活力有非常明顯的抑制作用(P<0.05)。5 mmol·L-1的Mn2+對(duì)HaGOX重組酶活力有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，其余金屬離子及化學(xué)試劑在1和5 mmol·L-1濃度下對(duì)HaGOX均沒有明顯影響。

注：*、**和*** 分別表示不同組的差異在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note：*, ** and *** indicate significant differences among different treatments at P<0.05, P<0.01 and P<0.001 levels, respectively.圖5 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)HaGOX酶活性的影響Fig.5 Effect of metal ions and chemical reagents on HaGOX

2.3.3HaGOX的底物特異性分析 選取常見的單糖、二糖作為底物，測(cè)定HaGOX酶活力。從表1可以看出，6-脫氧-葡萄糖為HaGOX的最適底物，D-葡萄糖次之，HaGOX對(duì)L-鼠李糖和D-纖維二糖有微弱的催化作用，但無法計(jì)算出具體的酶活力。而HaGOX對(duì)2-脫氧-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、α-乳糖、蔗糖、D-山梨糖無催化活性。

表1 HaGOX底物特異性Table 1 Subsrate specificity of HaGOX

3 討論

Tang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，人工飼料喂養(yǎng)的5齡期棉鈴蟲唇腺GOX活性比取食植物葉片要高，還發(fā)現(xiàn)葡萄糖能夠誘導(dǎo)GOX活性的顯著提高。本研究選取2齡期棉鈴蟲開始人工喂養(yǎng)，分別收集4齡期、5齡期、6齡期、蛾期的棉鈴蟲作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的樣本。同時(shí)，在3齡期向4齡期棉鈴蟲的成長(zhǎng)過程中作了兩份對(duì)照，一份為人工飼料喂養(yǎng)，另一份為飼料(含1%葡萄糖)喂養(yǎng)，以驗(yàn)證葡萄糖能否誘導(dǎo)GOX的提前表達(dá)。結(jié)果不同飼喂方式下4齡期棉鈴蟲均未克隆到hagox基因，而在5齡期和蛾期成功克隆到了目的基因，這一結(jié)果表明，葡萄糖未能成功誘導(dǎo)棉鈴蟲GOX的提前表達(dá)。

本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組HaGOX蛋白，并對(duì)重組HaGOX進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。重組HaGOX蛋白最適作用pH為6.0～7.0，在pH 5.0～8.5之間基本穩(wěn)定，最適作用溫度40℃，最適底物為6-脫氧-葡萄糖。Eichenseer 等[16]提取美洲棉鈴蟲體內(nèi)GOX蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，本研究結(jié)果與其一致，這說明重組HaGOX并未改變棉鈴蟲天然GOX的酶學(xué)性質(zhì)，后期可以使用本研究建立的表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)重組HaGOX，進(jìn)而進(jìn)行更深入的分析。與其他真菌來源的GOX相比[22]，HaGOX蛋白耐堿性更強(qiáng)，這將進(jìn)一步拓寬HaGOX在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。

昆蟲GOX的研究比較有限，Eichenseer 等[16]在成蟲棉鈴蟲表皮中檢測(cè)到GOX活性，幼蟲中未檢測(cè)到GOX活性，研究人員推測(cè)GOX可能會(huì)影響昆蟲骨化過程中蛋白質(zhì)的交聯(lián)，還有待進(jìn)一步證實(shí)。昆蟲GOX多被報(bào)道可以抑制植物防御，但Tian等[23]卻發(fā)現(xiàn)昆蟲GOX能夠誘發(fā)番茄防御反應(yīng)，初步判斷GOX可能不是直接作用于茉莉酸(JA)上游信號(hào)因子誘導(dǎo)JA途徑，并且與水楊酸(SA)途徑無關(guān)，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究成功實(shí)現(xiàn)了棉鈴蟲HaGOX在畢赤酵母中的異源分泌表達(dá)，且易于分離純化，重組HaGOX蛋白酶學(xué)性質(zhì)與天然蛋白一致。本研究結(jié)果將有力推進(jìn)棉鈴蟲GOX在侵染寄主植物過程中的作用機(jī)制研究，并有助于深入了解植物防御棉鈴蟲的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而為開拓新的棉鈴蟲防治策略提供新思路。